《Frontiers in Microbiology》：Spread potential and architectural variant of a multiple-drug resistant Escherichia coli co-producing lipopolysaccharide-modifying determinants and extended-spectrum β-lactamases
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背景：β-内酰胺类抗生素的滥用及其耐药性的传播挑战了抗菌药物的适用性，促使多粘菌素成为针对多重耐药（MDR）病原体感染的最终治疗选择。多粘菌素通过膜功能障碍、通透性损伤、囊泡-囊泡接触和氧化应激，可应用于草药育种/生长促进以及与其他抗菌药物联合抗击革兰氏阴性菌
背景：β-内酰胺类抗生素的滥用及其耐药性的传播挑战了抗菌药物的适用性，促使多粘菌素成为针对多重耐药（MDR）病原体感染的最终治疗选择。多粘菌素通过膜功能障碍、通透性损伤、囊泡-囊泡接触和氧化应激，可应用于草药育种/生长促进以及与其他抗菌药物联合抗击革兰氏阴性菌，但其耐药性日益普遍。然而，多粘菌素耐药的复杂机制和高传播风险对公共卫生构成严重威胁，例如提高大肠杆菌（Escherichia coli）的定植优势和感染风险。方法：在本研究中，研究人员从一份尿液样本中分离出一株能够产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的多粘菌素耐药大肠杆菌，此后命名为EcE.ESBL.COL。抗菌药物敏感性试验和全基因组测序显示，该菌株可能携带多种抗生素耐药决定因子。结果：因此，这些候选因子被发现位于该菌株的一条染色体（另一个ST1485代表菌株（O83:H42）中未检测到一个整合子样MDR区域）和三个质粒（包括blaTEM ? 1B和blaCTX ? M?55）上，属于多位点序列分型（MLST）1485和血清型O25:H42。有趣的是，在其他远缘相关菌株中（例如，大肠杆菌菌株LWY24的染色体（先前为ST93，在研究人员的研究中重新分类为ST457）和由大肠杆菌菌株FXCREC004（ST101）携带的质粒pFXCREC004-1），这种具有相似排列的可塑性基因组区域位于染色体或质粒上。接下来，研究人员在EcE.ESBL.COL染色体上发现了一个arnBCADTEF操纵子，没有mcr样决定因子，促进脂多糖（LPS）中脂质A的4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）修饰。有趣的是，从枸杞（Lycium barbarum）中提取的额外多糖（LBP）和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）增强了arn介导的多粘菌素耐药性，而与粘菌素联合使用未观察到显著的抗菌协同作用。此外，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和比较转录组学证明，LPS的产生和形态在多粘菌素应激下显著变化，表明多粘菌素可诱导arnBCADTEF的转录，从而促进L-Ara4N修饰和多粘菌素耐药性。结论：总体而言，研究结果表明，抗生素耐药因子（如该分离株中的MDR候选因子和LPS结构变异）的共现涉及染色体重组和质粒传播，从而强调了对抗菌药物耐药性监测、分子流行病学回顾和精准临床抗感染的重要启示。
抗生素滥用已加速多重耐药（MDR）细菌的出现与传播，使多粘菌素成为对抗泛耐药病原体的最后治疗选择。然而，多粘菌素耐药机制复杂，且与β-内酰胺类耐药共现，严重威胁临床抗感染治疗和公共卫生。多粘菌素主要通过靶向革兰氏阴性菌外膜的脂多糖（LPS）发挥杀菌作用，其耐药常与LPS的化学修饰相关，包括质粒介导的磷酸乙醇胺（pEtN）修饰（由mcr样基因编码）和染色体armBCADTEF操纵子介导的4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）修饰。这些修饰降低LPS负电荷，削弱多粘菌素结合。此外，多种天然产物或抗氧化剂作为多粘菌素增敏佐剂的研究日益增多，但其作用靶点尚不明确。因此，深入解析同时产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和多粘菌素耐药的大肠杆菌的基因组结构和转录响应，对于理解耐药传播与进化具有重要意义。
本研究从一份临床尿液样本中分离出一株命名为EcE.ESBL.COL的大肠杆菌。研究人员通过抗菌药物敏感性试验、全基因组测序、比较基因组学、接合实验、活性氧（ROS）检测、LPS提取分析与电泳、RT-qPCR及比较转录组学等手段，系统表征了其耐药特征、遗传背景和多粘菌素耐药机制。该菌株属于ST1485型，血清型为O25:H42，对包括β-内酰胺类、多粘菌素在内的12种抗菌药物耐药。基因组分析显示其含有一条约5.04 Mb的染色体和三个质粒，染色体上携带一个整合子样MDR区域及arnBCADTEF操纵子，质粒上携带blaTEM ? 1B和blaCTX ? M?55等耐药基因。研究还发现，来自枸杞的多糖（LBP）和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可增强arn介导的多粘菌素耐药，但与粘菌素联合未见协同杀菌作用。通过SDS-PAGE和转录组学证实，多粘菌素可诱导arnBCADTEF转录，促进L-Ara4N修饰，改变LPS形态，导致高水平耐药。该研究揭示了染色体重组和质粒传播在耐药基因共现中的作用，为耐药监测和精准抗感染治疗提供了新见解。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。
技术方法方面，菌株分离自上海东方医院住院患者尿液。主要方法包括：采用VITEK 2系统和肉汤微量稀释法检测抗菌药物敏感性；利用Illumina和高通量纳米孔测序进行全基因组测序，用Unicycler组装；通过MLST、血清型分析、质粒分型、系统发育树构建等生物信息学工具进行基因组分析；以大肠杆菌25DN为受体进行接合实验；使用DCFH-DA荧光探针检测ROS；利用SDS-PAGE和鲎变形细胞裂解物（LAL）法分析LPS；通过RT-qPCR和RNA-seq进行转录组分析。
结果部分包括以下内容：
**菌株鉴定与抗菌药物敏感性试验**：通过VITEK 2和药敏试验证实该菌株为MDR，对12种抗菌药物耐药，包括多种β-内酰胺类和多粘菌素（粘菌素MIC为16 μg/mL），因此命名为EcE.ESBL.COL。LBP和NAC单独使用无显著抗菌活性，与粘菌素联合时FICI显示无协同或拮抗，反而可能削弱粘菌素的杀菌作用。
**基因组测序及一般特征**：全基因组测序显示该菌株含一条约5.04 Mb染色体（GC含量50.46%）和三个质粒（大小分别为167,587 bp、78,689 bp和1,998 bp），携带多种耐药基因，如磺胺类（sul2）、氨基糖苷类（aph(3″)-Ib、aph(6)-Id）、四环素类（tet(A)）和酰胺醇类（floR）。
**综合基因组学**：系统发育分析表明该菌株与ST1485参考株CFSAN061771亲缘最近，但O抗原血清型不同（O25 vs O83）。比较基因组学发现，染色体上存在一个约5.2 kbp的MDR区域，该区域在CFSAN061771中缺失，但在其他远缘菌株（如LWY24染色体和pFXCREC004-1质粒）中同源，提示可通过水平基因转移传播。此外，染色体上存在完整的arnBCADTEF操纵子，但未检出mcr基因。
**质粒复制子类型和特征基因**：pEcE.ESBL.COL-01和pEcE.ESBL.COL-02均为IncF型质粒。pEcE.ESBL.COL-01携带dfrA14、sul2、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、blaTEM ? 1B和blaCTX ? M?55；pEcE.ESBL.COL-02携带sul2、fosA3、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、tet(A)、floR、blaTEM ? 1B和blaCTX ? M?55。两个质粒均含有毒素-抗毒素（TA）系统（vapBC、ccdAB或pemIK），有助于质粒稳定遗传。接合实验证明blaCTX ? M?55可水平转移至受体菌。
**粘菌素联合LBP或NAC对ROS水平的影响**：利用DCFH-DA探针检测发现，当粘菌素浓度低于1 × MIC时，LBP能显著降低菌株的ROS水平；NAC与不同浓度粘菌素联合均能显著降低ROS水平。
**比较转录组学和RT-qPCR**：RNA-seq分析显示，与单独粘菌素组相比，LBP+粘菌素组有1,524个差异表达基因（DEGs），NAC+粘菌素组有267个DEGs。GO和KEGG富集分析表明上调基因涉及核糖体、氨酰-tRNA生物合成、鞭毛组装、细菌趋化性、双组分系统等通路。RT-qPCR验证了eptA、arnT、lptA和tssB等与LPS修饰、运输和细菌适应性相关的基因在联合处理组中上调，提示LBP和NAC可增强菌株对粘菌素的耐药性。
**脂质A修饰确定**：该菌株对多粘菌素B和粘菌素的MIC分别为32 μg/mL和16 μg/mL，显著高于文献报道的4–8 μg/mL。基因组中未检出mcr，但染色体上存在arn操纵子。SDS-PAGE分析显示，与对照相比，多粘菌素处理组的LPS电泳图谱发生明显变化，表明L-Ara4N修饰发生。LAL试验检测到游离LPS含量变化，RT-qPCR证实LPS合成相关基因转录水平改变。综上，多粘菌素应激可诱导arnBCADTEF转录，促进L-Ara4N修饰，改变LPS结构，降低多粘菌素结合能力，导致高水平的耐药性。
讨论部分指出，EcE.ESBL.COL同时具备染色体介导的arn操纵子和质粒介导的多种耐药基因，其耐药共现主要归因于染色体重组和可移动元件的水平转移。IncF质粒因携带多种耐药基因和TA系统，在MDR传播中起关键作用。O抗原变异与arn修饰协同作用，改变LPS构象和电荷，进一步增强多粘菌素耐药。LBP和NAC虽能影响LPS合成和氧化应激，但均未恢复多粘菌素敏感性，反而可能增强耐药，提示在应用佐剂逆转耐药时需要谨慎评估其综合效应。
研究结论可翻译为：总之，研究人员从尿液样本中分离出一株多粘菌素耐药大肠杆菌，命名为EcE.ESBL.COL。全基因组测序分析显示，该菌株含有一条染色体和三个质粒，属于ST1485型，血清型为O25:H42。进一步比较基因组学鉴定了多个与ESBL产生相关的耐药基因，特别是染色体上的MDR整合子样区域、pEcE.ESBL.COL-01上的blaTEM ? 1B以及pEcE.ESBL.COL-02上的blaTEM ? 1B/blaCTX ? M?55。结合基因组分析和SDS-PAGE结果，研究人员推测该菌株的高水平多粘菌素耐药主要归因于arn操纵子介导的LPS结构修饰，以及相关的O抗原变异。总的来说，该研究揭示了LPS结构修饰相关的多粘菌素耐药多样性，并为在额外佐剂引起的“权衡”下ESBL和Arn决定因子共现的比较基因组学提供了新见解。
