Carnosic acid通过调控CXCL12/CXCR7轴减轻胃癌中的5-氟尿嘧啶化疗耐药并增强CD8+ T细胞细胞毒性

《Frontiers in Immunology》：Carnosic acid alleviates 5-Fluorouracil chemoresistance and enhances CD8+ T cell cytotoxicity in gastric cancer by regulating the CXCL12/CXCR7 axis

　　

摘要

背景：胃癌（gastric cancer, GC）的关键特征包括其侵袭性、高转移能力以及复发倾向。尽管5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）仍是GC治疗的基石，但其疗效因获得性耐药的产生而大幅削弱。鼠尾草酸（carnosic acid, CA）具有抗肿瘤和免疫调节潜力，但其在5-FU耐药的GC中的作用仍不明确。本研究探讨了CA是否通过调控CXCL12/CXCR7轴增强5-FU敏感性及CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫。

方法：研究利用5-FU敏感和5-FU耐药的GC细胞模型以及MFC/MFC-R小鼠GC模型，评估了CA联合5-FU对细胞活力、增殖、凋亡、迁移、侵袭及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关特征的影响。通过CXCR7过表达、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）、免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blotting）检测CXCL12/CXCR7轴的调控。进一步采用GC细胞/CD8⁺ T细胞共培养、皮下肿瘤、肺转移、抗PD-L1联合治疗及安全性模型进行验证。

结果：5-FU耐药的GC细胞表现出药物敏感性降低和恶性表型增强。CA联合5-FU抑制了增殖、迁移、侵袭和EMT，同时促进凋亡。机制上，CA通过抑制异常的CXCL12/CXCR7轴激活恢复5-FU敏感性，而CXCR7过表达可部分逆转这些效应。联合治疗还增强了CD8⁺ T细胞的增殖、细胞毒性以及IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B）的表达，降低了免疫抑制相关分子，抑制了肿瘤生长和肺转移，增强了抗PD-L1疗效，且未引起明显的全身毒性。

结论：CA通过靶向CXCL12/CXCR7轴，增强5-FU敏感性，抑制EMT和转移相关表型，并改善耐药GC中CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫。

图形摘要
耐药胃癌细胞对5-FU的敏感性可通过引入鼠尾草酸（CA）而增强。该效应可能与抑制耐药细胞中异常的CXCL12/CXCR7轴激活有关，从而抑制细胞增殖、上皮-间质转化和转移相关表型，同时促进凋亡并增强CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。

亮点
鼠尾草酸（CA）通过提高化疗敏感性显著恢复胃癌细胞对5-FU的敏感性。
CA与5-FU联合使用可同时抑制耐药胃癌细胞的侵袭性行为，包括增殖、迁移、侵袭和EMT。
CA通过抑制CXCL12/CXCR7信号轴有效靶向并减轻5-FU耐药相关的恶性表型。
CA与5-FU联合使用时，可协同增强抗PD-L1治疗的治疗潜力，其获益归因于增强的CD8⁺ T细胞细胞毒性。

鼠尾草酸在胃癌化疗耐药与免疫治疗中的增敏作用——基于CXCL12/CXCR7轴的机制解读

一、研究背景与问题

胃癌（gastric cancer, GC）作为消化道最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的主要原因。由于早期病变常缺乏特异性症状，多数患者在确诊时已处于进展期，导致总体预后欠佳。对于晚期或术后复发转移的GC患者，系统性化疗仍是最重要的治疗手段，其中5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）是临床GC化疗方案的核心药物。然而，获得性耐药是制约5-FU疗效的关键瓶颈，大多数患者最终会产生耐药，中位进展时间仅0至8个月。值得注意的是，接受5-FU为基础的新辅助化疗后残留肿瘤的BMI1阳性率显著高于未治疗肿瘤（58.3%对35.0%），且与更差的3年无复发生存率相关（HR=2.455）。除化疗耐药外，免疫治疗应答有限也是晚期GC面临的另一临床挑战。在针对中国晚期胃或胃食管交界处腺癌患者的III期ORIENT-16试验中，信迪利单抗联合化疗在总体人群中的客观缓解率为58.2%，在联合阳性评分（combined positive score, CPS）≥5的患者中为63.6%。因此，阐明5-FU耐药的分子驱动因素并探索使肿瘤细胞对化疗增敏的创新策略，对于优化GC的临床预后至关重要。

5-FU的主要抗肿瘤机制包括抑制胸苷酸合酶、干扰核酸合成以及增强DNA损伤。然而，持续的药物胁迫迫使GC细胞通过多种途径获得耐药，如药物摄取减少、药物外排加速、DNA修复增强、程序性细胞死亡抑制以及生存相关信号级联激活。这一过程常伴随其他侵袭性表型，包括持续增殖、迁移和侵袭激活以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的发生。除肿瘤细胞内在耐药外，肿瘤免疫景观的重塑已成为决定化疗成败的关键因素。CD8⁺ T淋巴细胞是GC微环境中主要的效应细胞群，通过释放穿孔素、颗粒酶B（Granzyme B）和干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）等细胞毒性介质杀伤肿瘤细胞。然而，长期化疗压力和免疫抑制微环境可限制CD8⁺ T细胞增殖、降低细胞毒性活性并诱导耗竭表型。此外，肿瘤 compartment 中PD-L1的过表达及T淋巴细胞负调控信号的放大共同驱动免疫逃逸。

趋化因子及其受体在肿瘤进展、转移播散、免疫细胞募集和治疗耐药中发挥关键作用。C-X-C基序趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12, CXCL12）与其受体CXCR4和CXCR7构成的信号轴是肿瘤微环境中的核心调控趋化因子轴。其中CXCR7与多种肿瘤的恶性进展密切相关。临床证据显示，在150例GC患者队列中，CXCR7高表达与淋巴结转移和晚期TNM分期显著相关，且CXCR7阳性患者的中位总生存期显著短于阴性患者（40个月对75个月）。因此，CXCL12/CXCR7轴的异常激活可能通过促进5-FU耐药和免疫逃逸参与GC的恶性进展和治疗耐受。

鼠尾草酸（carnosic acid, CA）是一种天然酚二萜类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。研究人员前期研究表明，CA可通过调控CXCR7/CXCL12轴抑制胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，CA能否通过调节CXCL12/CXCR7轴逆转GC的5-FU耐药并增强CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫，尚需系统阐明。

二、研究主要技术方法

研究人员建立了人GC细胞系（HGC27、MKN45、BGC823、AGS）和小鼠GC细胞系MFC的5-FU耐药亚系（诱导期约8至10个月），以BGC823-R和MFC-R作为主要耐药模型。研究采用CCK-8法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞毒性，Calcein AM/PI活死细胞染色、EdU增殖实验、集落形成实验、流式细胞术检测凋亡、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验、失巢凋亡（anoikis）实验、免疫荧光染色、蛋白质印迹法（Western blotting）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）等方法进行体外机制解析。免疫学研究中，从615小鼠脾脏分离CD8⁺ T细胞（纯度达92.5%），并与GC细胞共培养，利用CFSE实验检测CD8⁺ T细胞增殖。体内实验采用615小鼠皮下肿瘤模型和尾静脉注射肺转移模型，并结合CXCR7过表达、抗PD-L1联合治疗及安全性评价模型进行验证。

三、研究结果

3.1 CA增强5-FU的细胞毒性作用并抑制5-FU耐药GC细胞的增殖
CCK-8实验显示，5-FU耐药细胞较亲本细胞维持更高活力且IC50值增加，证实耐药模型成功建立。CA对正常胃上皮细胞（GES-1、GSM06）活力影响较小，但以浓度依赖方式抑制耐药细胞活力。联合用药较单药更显著抑制细胞活力、增加LDH释放、提高死亡细胞比例，并抑制增殖和集落形成能力，同时提高凋亡率。

3.2 CA增强5-FU对耐药GC细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用
划痕愈合和Transwell实验显示，CA联合5-FU进一步降低耐药细胞的迁移和侵袭能力。免疫荧光和Western blotting显示，联合治疗增强E-钙黏蛋白（E-cadherin）和EpCAM表达，降低N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）水平，并下调EMT相关转录因子Snail、Twist1和ZEB1。失巢凋亡实验表明联合治疗提高了耐药细胞的失巢凋亡率。

3.3 CA联合5-FU在共培养体系中抑制耐药GC细胞并改善CD8⁺ T细胞功能
在GC细胞/CD8⁺ T细胞共培养体系中，联合治疗进一步降低肿瘤细胞活力、增加死亡和凋亡，同时下调肿瘤细胞PD-L1表达。联合治疗减少CD8⁺ T细胞LDH释放和凋亡，促进其增殖，并上调IFN-γ和Granzyme B表达，表明CD8⁺ T细胞效应功能增强。

3.4 CA联合5-FU抑制耐药GC细胞中CXCL12/CXCR7轴激活
Western blotting显示，5-FU耐药细胞较亲本细胞显著上调CXCR7和CXCL12表达。CXCR7过表达可部分恢复5-FU处理后耐药细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力，维持EMT表型并上调耐药相关蛋白P-gp、MRP1和LRP。CA联合5-FU显著下调CXCR7和CXCL12表达，免疫共沉淀证实CXCL12与CXCR7之间存在相互作用。

3.5 CA通过抑制CXCL12/CXCR7轴恢复耐药GC细胞对5-FU的敏感性
CXCR7过表达可部分逆转5-FU+CA对细胞活力、LDH释放、死亡和凋亡的影响，恢复细胞增殖能力，并部分恢复迁移、侵袭能力及EMT相关蛋白表达，同时部分恢复耐药相关蛋白P-gp、MRP1和LRP的水平。

3.6 CA通过抑制CXCL12/CXCR7轴增强5-FU介导的CD8⁺ T细胞功能
在共培养体系中，CXCR7过表达部分逆转5-FU+CA对CD8⁺ T细胞的保护作用，表现为增加CD8⁺ T细胞LDH释放和凋亡、降低增殖能力。Western blotting显示，CXCR7过表达降低了IFN-γ和Granzyme B表达，并部分恢复抑制性受体PD-1、CTLA4和LAG-3的水平。

3.7 CA通过抑制CXCL12/CXCR7轴增强5-FU的体内抗肿瘤疗效并促进CD8⁺ T细胞抗肿瘤应答
在MFC-R皮下肿瘤模型中，5-FU+CA显著抑制肿瘤生长、促进肿瘤组织损伤和凋亡、降低Ki67表达，并增加CD8⁺细胞浸润及IFN-γ和Granzyme B表达。CXCR7过表达部分削弱上述抗肿瘤效应。

3.8 CA联合5-FU增强抗PD-L1治疗的体内抗肿瘤疗效
5-FU+CA+anti-PD-L1三药联合方案较抗PD-L1单药更显著抑制肿瘤生长、促进凋亡、抑制增殖，并增加CD8⁺细胞浸润及IFN-γ和Granzyme B表达，同时下调CXCL12和CXCR7表达。

3.9 CA通过抑制CXCL12/CXCR7轴增强5-FU对体内EMT和肿瘤转移的抑制作用
在肺转移模型中，5-FU+CA显著减少肺表面结节和内部转移灶，增加E-cadherin表达、降低N-cadherin水平，并下调Snail、Twist1和ZEB1表达。CXCR7过表达部分逆转这些抗转移效应。

3.10 CA在小鼠中表现出良好的安全性
CA治疗组小鼠体重变化趋势与对照组一致，血清ALT、AST、BUN和CRE水平无明显差异，肝脏和肾脏组织学结构完整，未见明显病理损伤。

四、讨论与结论

讨论部分指出，GC化疗耐药不仅表现为药物敏感性降低，还伴随持续增殖、凋亡逃逸、迁移侵袭增强和EMT激活。CA通过增强5-FU对耐药细胞的抑制作用，表现为降低细胞活力和增殖、增加细胞损伤和凋亡，从而发挥化疗增敏作用。EMT是肿瘤细胞获得侵袭转移能力和治疗耐受的重要机制，CA联合5-FU可抑制耐药细胞的迁移、侵袭和EMT相关活性，同时促进失巢凋亡。关于CXCL12/CXCR7轴，研究表明STAT3和PI3K/Akt是其重要的下游信号通路。CXCL12/CXCR7激活可通过STAT3信号促进食管癌的EMT和转移行为，CXCR7敲低可抑制PI3K/Akt和β-arrestin信号及肿瘤细胞增殖和侵袭。在GC中，CXCL12 contributes to anti-PD-1 resistance，而CXCL12敲低可增加瘤内CD8⁺ T细胞和IFN-γ⁺细胞并减少MDSC积累。PI3K/Akt/HIF1A信号与CD8⁺ T细胞耗竭和PD-L1上调有关，提示该通路可能在致癌信号与抗肿瘤T细胞功能受损之间提供机制联系。本研究发现，5-FU耐药GC细胞中CXCR7和CXCL12表达显著升高，CXCR7过表达促进耐药细胞在5-FU处理下的存活、增殖和运动能力，并上调P-gp、MRP1和LRP等耐药标志物。CA联合5-FU抑制CXCR7和CXCL12表达，CXCR7过表达部分削弱其调控作用，进一步支持CXCL12/CXCR7轴参与CA介导的5-FU增敏。在免疫调节方面，CA联合5-FU可刺激CD8⁺ T细胞扩增和效应分子产生、减少CD8⁺ T细胞凋亡，同时降低肿瘤细胞PD-L1以及CD8⁺ T细胞上PD-1、CTLA4和LAG-3等抑制性标志物的水平。CXCR7过表达部分削弱这些免疫增强效应。体内实验进一步证实，CA联合5-FU抑制MFC-R皮下肿瘤生长和肺转移、促进凋亡、增强CD8⁺ T细胞浸润及IFN-γ和Granzyme B表达，并改善抗PD-L1治疗的疗效。安全性评价显示CA具有良好的体内耐受性。研究局限性包括：主要聚焦于CXCL12/CXCR7轴，CA调控该通路的上游事件尚未完全明确；STAT3和PI3K/Akt的激活及功能贡献未被直接检测；实验证据主要来源于耐药细胞模型和小鼠肿瘤模型，需要患者来源样本、类器官或临床耐药GC组织进一步验证；肿瘤微环境中免疫细胞群体的更全面表征有待深入；未来还需评估CA联合化疗或免疫治疗时的药代动力学特性、长期安全性和最佳给药策略。

结论部分：研究揭示，CA通过抑制病理活化的CXCL12/CXCR7信号使化疗耐药的GC细胞对5-FU增敏。此外，CA抑制EMT和转移特征，同时增强CD8⁺ T细胞驱动的免疫介导肿瘤清除。CA具有化疗增敏和免疫激活的双重调节作用，为其作为克服5-FU耐药和优化GC chemo-immunotherapy的辅助策略提供了实验依据。