犬类年轻与老年比格犬队列中免疫与代谢衰老的多组学谱分析

《Frontiers in Immunology》：Multiomic profiling of canine immune and metabolic aging in a cohort of young and senior beagles

　　

引言：生物衰老被定义为生理完整性与稳态能力渐进性下降，由分子损伤累积驱动并导致疾病易感性增加。Lopez-Otin等将这一过程形式化为衰老标志，包括基因组不稳定、端粒损耗、表观遗传改变、蛋白稳态丧失、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭和细胞间通讯改变，这些机制在物种间广泛保守，为研究犬类衰老提供框架。在衰老标志中，细胞间通讯改变常表现为慢性低度炎症即炎症衰老，是年龄相关疾病的关键驱动因素。免疫衰老与免疫细胞内代谢重编程紧密耦合，这种串扰称为免疫代谢(immunometabolism)。免疫系统既是机体应激传感器，也是系统性衰退介质，整合多组织信号并促进多病共存进展。人类中，系统级高通量组学已广泛用于衰老研究，产生免疫组成、基因表达、表观遗传状态和循环代谢物的年龄相关大尺度图谱。相比之下，犬类衰老研究多使用单一模态或小队列，限制了对免疫与代谢重塑的整合认识。既往研究已开始描绘衰老对犬免疫系统影响，报道适应性免疫细胞如CD4+ T细胞与B细胞下降，髓源性抑制样细胞(MDSC like)增加，未成熟中性粒细胞积聚，衰老样CD8+ T细胞伴线粒体功能障碍，形成免疫衰老状态；还观察到发育与代谢基因程序及DNA甲基化和染色质可及性改变。为推进犬免疫代谢领域，研究人员在特征明确的健康年轻与老年比格犬队列中开展跨尺度多组学研究。 方法：研究人员对50只犬进行非靶向血清代谢组学，其中25只老年、25只年轻。对39只犬子集进行全血bulk RNA测序(bulk RNAseq)，其中19只老年、20只年轻，并采集完整血细胞计数(CBC)与血清生化指标。对30只犬子集进行外周血单核细胞(PBMC)单细胞RNA测序(scRNAseq)，其中15只年轻、15只老年。研究获得约318,000个PBMC转录组，为迄今最大犬类单细胞数据集，并分辨27个免疫群体。全血RNA来自PAXgene管稳定样本，保留粒细胞群；PBMC来自密度梯度分离单核细胞层。多组学与外部国际小鼠表型联盟(IMPC)、Zoonomia、开放靶点(Open Targets)及人与犬全基因组关联研究(GWAS)整合。 结果：年龄使犬PBMC组成向髓系扩张与初始淋巴细胞丢失偏移。研究人员通过质控获约318,000高质量PBMC转录组，每细胞中位检出1,669基因，聚类分7大免疫谱系与27群体。老年犬单核细胞频率名义升高，粒细胞趋势增加，树突状细胞显著减少；B细胞显著减少，CD4+ T细胞趋势减少，CD8+ T细胞显著增加。亚群中，初始CD4+ T细胞大幅减少，Th1样细胞显著扩张，Th1/Th2平衡升高，γδ T细胞近消失；初始B细胞与浆细胞名义减少。该组成变化呈现典型免疫衰老模式，即选择性髓系与促炎群体扩张、初始淋巴细胞耗竭。 衰老消耗犬PBMC中细胞周期与DNA修复通路并激活炎症信号。伪批量(pseudobulk)差异表达获90个差异基因(DEG)；基因集富集分析(GSEA)显示老年上调补体与凝血级联、Toll样受体信号、NF-κB、TNF、MAPK与Th1/Th2分化、自然杀伤细胞介导细胞毒性的通路；下调核糖体、细胞周期检查点、DNA复制与碱基切除修复等程序，表明循环免疫细胞炎症信号增强而增殖与基因组维护程序减弱。 全血bulk转录组学强化炎症激活与细胞周期耗竭签名。39只犬bulk RNAseq鉴定3,265个显著DEG，其中1,636上调、1,629下调；与单细胞伪批量方向高度一致。下调富集细胞周期、DNA复制与DNA修复，上调富集NF-κB、TNF、MAPK、IL-17与AGE-RAGE信号。因全血含大量粒细胞，固有免疫与炎症签名主要由粒细胞分数驱动，与PBMC单细胞髓系扩张互为补充。 单细胞分辨率下各免疫细胞对衰老签名的贡献被解析。逐细胞类型GSEA发现中性粒与cDC1显著富集TNF、NF-κB与炎症反应；适应细胞如周期T细胞、CD8+ 效应/初始细胞则耗竭补体、血小板活化与FcγR介导吞噬等通路。共有25个GO与KEGG项在不同谱系方向相反，说明聚合PBMC签名掩盖谱系特异差异，固有谱系炎症增强、适应谱系通路受抑。 转录组与代谢组揭示缩醛磷脂(plasmalogen)等醚脂与中枢代谢中间体广泛耗竭。50犬血清非靶向代谢组检测1,001代谢物，73个差异丰度代谢物(DAM)。老年犬初级/次级胆汁酸与色氨酸代谢物累积；缩醛磷脂、长链多不饱和脂肪酸(n3/n6)、鞘磷脂(sphingomyelin)、溶血缩醛磷脂(lysoplasmalogen)、二羟脂肪酸与神经酰胺(ceramide)显著耗竭。免疫细胞中脂质信号转录上调，可能是对循环膜相关脂质耗竭的代偿。PUFA与氧脂素(oxylipin)耗竭提示炎症消退能力受损；核苷酸与氨基酸分解产物累积提示细胞更新与损伤增加。适应免疫细胞TCA循环、有氧呼吸与氧化磷酸化转录受抑，全身呈分解代谢废物饱和而结构脂质缺乏表型。 bulk转录组与代谢组监督整合识别潜在分子衰老签名。DIABLO整合获15基因与30代谢物签名：老年累积尿毒症溶质与氨基酸分解物及对CCR5、GZMK等促炎/衰老标记上调；年轻累积P-16:0/20:4、P-16:0/22:6、P-16:0/16:0缩醛磷脂及溶血缩醛磷脂。加权基因共表达网络分析(WGCNA)得Turquoise模块（细胞周期活性，与醚脂正相关）与Green模块（免疫激活，与尿毒症毒素正相关），两模块特征基因显著负相关(R=-0.76, p=2.4×10-8)，提示结构脂质维持丧失与系统炎症上升共现，但非因果证明。 转录组与临床生物标志物将下调基因联系年龄相关性状。1,629个下调犬基因经Zoonomia映射到576个高置信小鼠直系同源；IMPC显示其表型含淋巴细胞数下降、体脂增加、糖耐量受损与骨密度下降。犬队列老年血清白蛋白显著低于年轻，与IMPC、BioAge模型方向一致；ALP、MCH、MCV部分一致。说明循环免疫细胞转录衰老可关联机体表型。 GWAS引导的转录组解读优先候选老化基因。39个犬寿命GWAS候选中11个在本队列差异表达，如BANK1限于初始B细胞，NLRP1与PLA2G4A限于单核/PMN-MDSC like。人衰老GWAS经Open Targets获26人候选，21有犬直系同源，与队列DEG交集得IRF4、AFF3、RPN1、TMEM263均下调。IRF4几乎仅在浆细胞表达且浆细胞随龄减少，人GWAS中L2G约0.95、eQTL共定位CLPP约0.94；AFF3敲除关联ALP升高与白蛋白降低，跨物种证据强。 讨论：研究人员指出，该研究结合最大犬PBMC单细胞图谱、bulk转录组、血清代谢组、临床标志物并与IMPC/Zoonomia/Open Targets整合，描述犬年龄相关免疫与代谢协调多层重编程。单细胞与bulk共同显示炎症衰老与细胞周期/DNA修复程序下降；全血粒细胞放大固有炎症信号。老年免疫“启动”于炎症反应而非适应多样性。缩醛磷脂作为内源牺牲抗氧化剂广泛丢失，PEX5而非核心过氧化物酶体合成基因下调，提示抗氧化防御与膜脂信号受损；鞘脂作为增殖/死亡变阻器重组。PLA2G4A在老年上调且表达于罕见髓系，具犬寿命GWAS信号，与PEX5下调和缩醛磷脂耗竭共同构成犬免疫代谢衰老可验证通路。 结论部分翻译：总之，本工作建立犬衰老生物学参考，并提供伴侣动物未来多组学研究可扩展框架。研究勾勒循环免疫细胞(PBMC与全血)、血清代谢物与临床生物标志物的犬免疫代谢衰老视图，并优先出具潜在作用候选基因供功能验证。该多组学资源可用于犬免疫学、代谢与比较衰老的多样问题。最终，利用此类整合资源可指导改善伴侣动物健康与延长寿命的策略开发与检测。 研究局限：横断面、单品种、极端表型设计不能刻画连续衰老；仅血液/血清，未测组织驻留免疫与实质器官；PBMC低估总粒细胞；未涵盖一碳代谢与DNA甲基化等表观层面；小鼠无效等位表型不等同部分表达下调；人GWAS位点至基因推定可能不保守。 论文发表于《Frontiers in Immunology》。

研究背景：生物衰老指生理完整性与稳态能力渐进下降，由分子损伤累积驱动。Lopez-Otin等提出衰老标志在物种间保守。细胞间通讯改变表现为炎症衰老，免疫与代谢在免疫细胞内通过免疫代谢耦合。人类已用系统级组学研究的免疫、表观与代谢年龄变化；犬类研究却多单模态、小队列，难建免疫—代谢整合视图。既往犬研究虽见CD4⁺ T/B细胞下降、MDSC like增加、未成熟中性粒细胞堆积、衰老样CD8⁺ T伴线粒体障碍，以及发育代谢程序与表观改变，但缺跨尺度资源。因此研究人员以健康年轻(<5岁)与老年(>9岁)比格犬建立多组学参考，服务健康衰老与寿命干预。

主要关键技术方法：研究人员使用50只比格犬（25年轻、25老年）做非靶向血清代谢组学；39只比格犬（20年轻、19老年）做全血bulk RNAseq与临床 biomarker；30只比格犬（15年轻、15老年）做PBMC的scRNAseq。单细胞用Parse Biosciences全转录组方案与Illumina测序，bulk用PAXgene全血RNA建库与HISAT2/StringTie/DESeq2流程，代谢组由Metabolon非靶向UPLC-MS/MS并完成差异丰度分析。外部整合采用IMPC小鼠表型、Zoonomia直系同源、Open Targets人GWAS与犬GWAS，再用DIABLO与WGCNA做多组学监督整合与相关网络分析。

研究结果：

Aging skews canine PBMC composition toward myeloid expansion and loss of naive lymphocytes：通过30犬PBMC scRNAseq获约318,000细胞、27群体；老年单核/粒细胞增多、树突状减少，B与初始CD4⁺ 减少、CD8⁺ 增多，Th1样扩张与γδ T近消失，呈现髓系扩张伴初始淋巴耗竭的免疫衰老组成。

Aging depletes cell-cycle & DNA repair pathways, activates inflammatory signaling in canine PBMCs：伪批量DEG仅90个，但GSEA显示老年下调核糖体、细胞周期、DNA复制、碱基切除修复，上调补体凝血、Toll样受体、NF-κB、TNF、MAPK，证明PBMC炎症信号增强而修复/增殖程序减弱。

Whole blood bulk transcriptomics reinforce inflammatory activation and cell-cycle depletion aging signatures：39犬bulk RNAseq得3,265 DEG，与单细胞方向一致；全血因保留中性粒细胞使NF-κB/TNF等固有炎症签名更强，适应细胞相关周期/修复程序仍下调，提供系统级佐证。

Single-cell resolution identifies candidate contributors to aging signatures across immune cells：逐细胞类型GSEA显示中性粒细胞与cDC1驱动TNF/NF-κB/炎症反应，周期T与CD8⁺ 亚群耗竭补体/血小板活化/FcγR吞噬；25个通路方向在固有与适应谱系相反，说明聚合签名掩盖细胞类型特异机制。

Transcriptomics and metabolomics reveal extensive depletion of ether lipids and central metabolic intermediates：50犬代谢组示老年缩醛磷脂、鞘磷脂、神经酰胺、n3/n6 PUFA、氧脂素耗竭，胆汁酸与核苷酸/氨基酸分解物累积；转录上适应免疫细胞TCA、OXPHOS受抑而脂质信号上调，反映膜脂防御下降与炎症消退能力受损。

Supervised integration of bulk transcriptomics and metabolomics identifies a potential molecular aging signature：DIABLO选15基因+30代谢物；WGCNA得Turquoise（细胞周期，正关缩醛磷脂）与Green（免疫激活，正关尿毒症毒素），模块特征基因R=-0.76，提示年轻“增殖/膜脂”向老年“炎症/分解代谢”轴转移。

Transcriptomics and clinical biomarkers associate downregulated genes with age related traits：下调犬基因映射IMPC正交，关联淋巴细胞减少、体脂/糖耐量/骨密度改变；老年血清白蛋白显著降低，与IMPC和BioAge方向一致，连接血液转录衰老与机体表型。

GWAS guided interpretation of transcriptomics prioritizes genes with a potential role in aging：犬GWAS中PLA2G4A、NLRP1等随龄在特定髓系/抑制样细胞表达；人GWAS交叉得IRF4、AFF3、RPN1、TMEM263下调。IRF4限浆细胞且人L2G高，AFF3敲除表型与白蛋白/ALP变化一致，跨物种候选性强。

讨论总结：研究人员认为该资源是迄今最大犬PBMC单细胞图谱与多组学框架，证明犬衰老为固有炎症增强、适应免疫萎缩、膜醚脂与鞘脂耗竭、分解代谢废物累积的协调程序。PEX5下调、PLA2G4A上调与缩醛磷脂丢失共同指向过氧化物体—磷脂酶—膜脂—炎症轴。局限在横断、单品种、极端年龄、仅血液、未做表观与组织、小鼠无效表型不等价于人犬因果推定。

结论翻译：总之，本工作建立犬免疫与代谢衰老外周血与血清多模态参考，提供指导伴侣动物健康与寿命干预的基础资源，并优先出候选基因供后续功能验证；该多组学资源可支撑犬免疫学、代谢与比较衰老研究。论文发表于《Frontiers in Immunology》。