极早产儿脐带血中NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体活性降低

《Frontiers in Pediatrics》：Reduced NLRP3, AIM2 and NLRC4 inflammasome activity in cord blood of extremely preterm infants

　　

背景：促炎性caspase-1是先天免疫的关键参与者。炎症小体/caspase-1通路的生理性激活支持宿主抵御病原体，而失调性激活则参与支气管肺发育不良等新生儿疾病的发病机制。尽管与足月儿相比，早产儿单核细胞分泌IL-1β减少，但不同炎症小体通路的全面功能特征研究仍缺乏。目的：特异性分析早产儿和足月儿脐带血及健康成人外周血中NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体的活性。方法：采用经过验证的全血测定方法特异性激活不同炎症小体，以IL-1β作为炎症小体/caspase-1激活的替代标志物进行分析，并通过RT-qPCR检测白细胞中炎症小体相关基因的表达。结果：与足月儿和成人相比，早产儿脐带血中NLRP3和AIM2炎症小体活性降低，尤其是胎龄<28周者；NLRC4炎症小体活性仅在胎龄<32周的早产儿中显著降低。足月儿与成人对照组之间未观察到显著差异。基因表达分析显示，NLRP3、AIM2、NLRC4、ASC、CASP1和IL1B呈年龄依赖性上调，表达水平从早产至足月妊娠逐渐增加，并进一步向成年期增加。结论：炎症小体/caspase-1通路活性与胎龄相关，且与足月儿或成人相比，早产儿中显著降低。这一发现与早产儿特异性疾病的高发病率形成对比，而失调的caspase-1激活被认为参与这些疾病的发病机制。未来研究应探讨出生后头几天内炎症小体活性的动态演变，以阐明其在新生儿疾病发生中的作用。

论文解读：早产儿脐带血中NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体活性降低的研究

促炎性caspase-1是先天免疫应答的关键介质，其在多蛋白复合物“炎症小体”中通过邻近诱导的自蛋白水解被激活，进而加工IL-1β和IL-18并介导细胞焦亡。炎症小体/caspase-1通路的生理性激活有助于病原体清除，而失调性激活则与多种新生儿疾病如支气管肺发育不良（BPD）、缺氧缺血性脑病和新生儿脓毒症的发病相关。既往研究虽然提示早产儿单核细胞分泌IL-1β的能力低于足月儿，但大多采用纯化单核细胞或外周血单个核细胞（PBMC），未能保留血浆可溶性因子和细胞间相互作用，也未涵盖中性粒细胞这一外周血中数量最多的白细胞亚群。此外，尚无研究系统评估全血环境中NLRP3、AIM2和NLRC4三种炎症小体在早产儿和足月儿中的功能状态。因此，研究人员采用经验证的全血测定方法，对早产儿、足月儿脐带血及健康成人外周血中三种炎症小体的活性进行了系统分析，并检测了相关基因表达，以阐明该通路的发育成熟规律及其与早产儿疾病易感性的关系。

该研究共纳入236名受试者，包括87名早产儿（胎龄23+2至36+6周）、72名足月儿（胎龄37+0至41+3周）和77名健康成人对照。脐带血样本来源于断脐后的脐静脉，成人外周血样本通过静脉穿刺获取。研究采用肝素锂管采集全血，并在6小时内启动全血测定。对于NLRP3炎症小体，用超纯LPS（10 ng/mL）刺激5.5小时以激活替代性NLRP3通路，再加入ATP（1 mM）作用30分钟激活经典NLRP3通路；对于AIM2炎症小体，在LPS预刺激后通过脂质体转染双链DNA poly(dA:dT)激活，并同时使用NLRP3特异性抑制剂MCC950阻断NLRP3信号；对于NLRC4炎症小体，则用鼠伤寒沙门氏菌SL1344株以MOI=10感染细胞，并在MCC950存在下特异性分析NLRC4活性。培养结束后收集上清液，采用流式微球阵列（CBA）定量IL-1β浓度，作为炎症小体/caspase-1激活的替代指标。另采集PAXgene Blood RNA管稳定血液样本，提取总RNA后逆转录，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测NLRP3、AIM2、NLRC4、ASC、CASP1和IL1B的mRNA表达，并以ACTB和GAPDH的几何均数或RPLP0作为内参进行归一化。统计分析采用Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验、Spearman等级相关以及多元线性回归模型。

研究结果部分如下：

3.1 患者特征：共236例受试者分为三组，早产儿平均胎龄30+6周，足月儿38+3周。所有分析样本均为剖宫产分娩，早产儿组有64%接受过完整疗程的产前糖皮质激素治疗，足月儿组则均未接受。两组新生儿性别、小于胎龄儿比例及脐动脉pH无显著差异，但早产儿组10分钟Apgar评分较低。

3.2 早产儿中替代性和经典NLRP3炎症小体活性降低：LPS单独刺激诱导的替代性NLRP3通路IL-1β分泌，以及LPS+ATP刺激的经典NLRP3通路IL-1β分泌，在早产儿中均显著低于足月儿和成人，而足月儿与成人之间无差异。NLRP3抑制剂MCC950可强烈抑制各组IL-1β分泌。按胎龄和出生体重进一步分层显示，胎龄<28周或出生体重<1000g的早产儿IL-1β分泌极度减少；经典NLRP3通路在晚期早产儿（32+0至36+6周）中保留分泌能力。Spearman相关分析证实胎龄与两种NLRP3通路的IL-1β分泌呈正相关。

3.3 早产儿AIM2炎症小体活性降低：在MCC950阻断NLRP3后，LPS+poly(dA:dT)刺激诱导的AIM2通路IL-1β分泌在早产儿组显著低于足月儿和成人，且胎龄<28周或出生体重<1500g时分泌极低，胎龄与IL-1β分泌正相关。值得注意的是，未加MCC950的全刺激条件下，足月儿组的IL-1β分泌反而高于早产儿和成人，提示NLRP3信号可能掩盖了AIM2通路的真实差异。

3.4 极低胎龄儿NLRC4炎症小体活性降低：沙门氏菌刺激在MCC950存在下引起的NLRC4介导IL-1β分泌在三组间总体无统计学差异，但按胎龄分层后发现胎龄<32周的早产儿IL-1β分泌显著低于足月儿，出生体重<1500g者也呈降低趋势。Spearman相关分析确认胎龄与NLRC4通路IL-1β分泌正相关。

3.5 胎龄是所测炎症小体通路最一致的预测因子：将IL-1β浓度分别按总白细胞、单核细胞或中性粒细胞计数归一化后，结果显示按总白细胞和单核细胞归一化仍保留随年龄增加的趋势，且足月儿与成人之间也出现显著差异；而按中性粒细胞归一化则减弱了年龄相关增加。多元线性回归分析纳入胎龄、白细胞总数、产前糖皮质激素暴露和脐动脉pH后，胎龄是替代性NLRP3、经典NLRP3和AIM2通路的最强独立预测因子；NLRC4模型中胎龄系数最大但未达显著。产前糖皮质激素暴露与胎龄高度负相关，其独立效应难以完全分离，但整体证据不支持糖皮质激素暴露解释早产儿的炎症小体活性降低。

3.6 早产儿炎症小体相关基因表达降低：未刺激的脐带血/外周血中，NLRP3、AIM2、NLRC4、ASC、CASP1和IL1B表达均随胎龄和年龄递增。足月儿组AIM2、NLRC4和ASC表达显著高于早产儿组；成人组的NLRP3、AIM2、ASC、CASP1和IL1B表达进一步高于足月儿组。早产儿内部按胎龄分层后，较高胎龄亚组的基因表达上调，且所有基因的表达均与胎龄呈正相关。

讨论部分指出，早产儿尤其是极早产/极低出生体重儿中NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体活性均显著降低，这与既往基于纯化单核细胞的研究一致，但本研究首次在全血水平证实该现象，并扩展至AIM2和NLRC4通路。产前糖皮质激素暴露虽作为混杂因素存在，但分亚组和回归分析均不支持其解释早产儿的低反应性。从临床意义看，替代性NLRP3通路的减弱可能损害早产儿对败血症病原体的快速全身体液免疫应答，增加早发型脓毒症风险。而出生时炎症小体活性低下与BPD等疾病中IL-1β过度产生之间的矛盾，提示炎症小体相关疾病中的失调激活可能发生在出生后，由氧中毒、感染或机械通气等环境因素驱动免疫细胞快速成熟。基因表达上调与功能活性增加的年龄依赖性趋势提示转录调控参与该通路的发育成熟，但成人期基因表达虽高于足月儿，全血功能活性却无差异，说明还存在转录后或细胞组成等额外调控机制。研究局限性包括：脐带血能否完全代表新生儿外周血仍有争议；未进行单细胞水平分析；仅以IL-1β作为功能读数，未检测IL-18、caspase-1活化和焦亡；母亲或胎儿并发症及产前糖皮质激素暴露与胎龄的强相关可能影响统计效力。

研究结论为：NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体活性在早产儿脐带血中显著降低，尤其是极低胎龄或极低出生体重儿，并与胎龄增加强相关，提示先天免疫成熟存在发育轨迹。这种功能性低反应性可能保护早期生命免受过度炎症，但同时可能增加对早发型脓毒症的易感性。出生时炎症小体活性低下与BPD等炎症小体相关新生儿疾病高发之间的表观矛盾，提示失调性激活可能出现在出生后，并可能由环境应激因素触发。未来研究应采用单细胞分辨率和纵向设计，探索出生后最初几天炎症小体活性的动态演变，以揭示免疫成熟机制，并制定平衡感染防御与炎症损伤保护的目标性免疫调节策略。该研究发表于《Frontiers in Pediatrics》。