由壳聚糖和透明质酸组成的褪黑素@外泌体水凝胶：一种基于外泌体疗法的用于伤口愈合的有前景敷料

《International Journal of Pharmaceutics》：Melatonin@Exosome hydrogel composed of chitosan and hyaluronic acid: A promising dressing for wound healing based on exosome therapy

　　

•我们的混合敷料是一种多功能伤口支架，由负载褪黑素的胎儿组织来源外泌体和壳聚糖 -PVP-HA- 甘油水凝胶制成。
•当达到混合聚合物网络中的生理 pH 条件时，水凝胶从溶胶状态转变为凝胶状态。
•这种转变形成了多孔互连的基质，证明适合递送治疗药物。
•MEL@EXO 水凝胶显著加速了大鼠全皮层皮肤伤口的愈合过程。
•经 MEL@EXO 水凝胶处理的伤口表现出强健的肉芽组织形成、大量的再上皮化和广泛的胶原积累。

引言
伤口愈合过程是一个漫长的、多阶段的过程（止血、炎症、增殖和重塑），由多种细胞群体和生化信号精确协调（Mascharak et al., 2022, Prasai et al., 2022）。如果该过程失败，可能导致感染或畸形，给严重皮肤损伤患者带来心理问题，并影响其整体健康状况（Han and Ceilley, 2017）。此外，慢性溃疡的经济负担巨大；据 Schneider 等人 (2021) 称，美国约有 650 万人患有此问题，仅此一项每年花费 250 亿美元（Schneider et al., 2021）。伤口愈合的效率通过瘢痕形成的速率和大小来衡量（Wu et al., 2024a）。如今，常规治疗通常包括抗生素以减少炎症、手术以及伤口敷料以保持受伤区域隔离和湿润（Glover et al., 2021, Xiong et al., 2024c）。商业化敷料通常是单效的，仅关注伤口愈合的一个阶段（Lv et al., 2024）。为了克服这些挑战，正在探索新的再生疗法。特别是，源自细胞的包涵体，即含有生长因子和 microRNAs 的纳米囊泡，已显示出巨大潜力。临床前研究证实，外泌体可以通过向靶细胞传输促再生信号（例如 microRNAs）来调节皮肤伤口愈合的所有阶段（Psaraki et al., 2022）。

几乎所有细胞类型都能分泌外泌体，这是一种直径在 30 到 150 纳米之间的细胞外囊泡（Thakur et al., 2021）。它们通常分布在体液中，包括血清、唾液、牛奶、脑脊液、尿液和精液（Psaraki et al., 2022）。外泌体提供至关重要的功能，如传输信号和运输调节生理功能的药物（Wang et al., 2019a）。胎儿是干细胞的潜在来源。研究表明，妊娠早期人类胎儿血液、肝脏和骨髓富含造血祖细胞 (HPCs)、SCID 重新定植细胞 (SRCs) 和间充质干细胞 (MSCs)（Campagnoli et al., 2000, Campagnoli et al., 2001, Gallacher et al., 2000, Péault, 1996）。Wang 等人最近的一项研究表明，源自胎儿皮肤分离的胎儿真皮间充质干细胞 (FDMSCs) 的外泌体，可能通过 Notch 信号通路刺激成体真皮成纤维细胞的运动和分泌能力来改善伤口愈合，为 FDMSC 来源外泌体在皮肤伤口治疗中的治疗潜力提供了新的见解（Wang et al., 2019b）。来自胎儿及其内部环境的外泌体是再生医学和组织修复的重要候选者（Rani and Ritter, 2016, Yang et al., 2022）。与原始细胞相比，源自干细胞的外泌体是再生用途的更优选，因为引发免疫反应或发育成畸胎瘤的风险降低（Jeong et al., 2011, Park et al., 2023）。在本研究中，也选择了源自胎儿组织的外泌体，因为它们与无瘢痕伤口愈合有关联。在成熟伤口中，愈合过程通常涉及纤维化和瘢痕形成，而胎儿伤口大多可以再生而不形成瘢痕（Schwartzfarb and Kirsner, 2012）。这种差异可能源于独特的细胞外基质 (ECM) 组成、更有结构的胶原组织、炎症减少以及生长因子信号改变的组合（Hohlfeld et al., 2005）。主要机制似乎涉及糖胺聚糖的持续增加，特别是 HA，这可能是由于透明质酸酶活性降低（Sawai et al., 1997, West et al., 1997）。根据以前的研究，胶原沉积也倾向于 III 型，交联较少，呈现出类似于正常皮肤而非瘢痕组织的篮状编织结构（Carter et al., 2009, Goldberg et al., 2007, Knight et al., 1993）。由于这些因素，提出胎儿来源的外泌体可能为再生信号提供一条生物学上重要的途径，以促进伤口愈合。

同时，褪黑素作为一种小分子物质，已被认为是伤口治疗的有效方法。褪黑素（N-乙酰 -5-甲氧基色胺）的小吲哚胺类中具有强烈的抗氧化和免疫调节作用众所周知。除了其在昼夜节律控制中的作用外，褪黑素还通过几种途径被证明可以改善伤口愈合（Park et al., 2023）。其强大的清除自由基能力减少了氧化应激，并降低了损伤部位的活性氧 (ROS)。此外，其抗炎作用包括抑制促炎介质（如 TNF-α和 C 反应蛋白 (CRP)），同时增强 IL-10 表达，从而影响巨噬细胞活性以促进组织修复（Liu et al., 2020, Sohn et al., 2024）。褪黑素还能刺激血管生成、胶原合成和成纤维细胞迁移——可能是采用促愈合信号通路。然而，褪黑素在体内代谢迅速，并可能从目标组织扩散 away。将褪黑素包裹在外泌体中可以极大地提高其治疗效用。确实，经褪黑素预处理的 MSCs 会产生含褪黑素的外泌体，并表现出增强的生物活性（Liu et al., 2020, Zhou et al., 2022）。例如，Liu 等人表明，经褪黑素处理的 MSC 外泌体显著抑制了促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α），并在糖尿病伤口模型中增加了抗炎 IL-10，导致血管生成和胶原沉积增强。外泌体表现出高稳定性，简化了储存，并且此外还作为固有的药物递送载体，允许治疗药物在递送阶段保持效力（Jeong et al., 2011, Jin et al., 2023, Park et al., 2023）。这种多功能性表明，将治疗药物与外泌体递送相结合可能在治疗应用中提供协同效益，并产生强效、可靠的再生化合物（Liu et al., 2020）。

然而，实现负载褪黑素外泌体复合物的连续、缓慢释放仍然是一个挑战。水凝胶是提供湿润、保护环境的亲水聚合物网络，并促进生物活性物质（如外泌体）的局部递送（Zhang et al., 2024）。为了将负载褪黑素的外泌体运输到伤口部位，可以采用可生物降解的水凝胶基质。通过整合天然和合成聚合物，可以形成模仿细胞外基质 (ECM) 并促进细胞迁移和生长的湿润三维 (3D) 支架（Antoszewska et al., 2024, ?alva et al., 2023, Wu et al., 2024a）。水凝胶通常被工程化用于以受控方式递送药物、生长因子或细胞。它们可以根据其响应性进行分类，并表现出对特定刺激的反应特性。例如，pH 敏感水凝胶会根据 pH 变化而膨胀、收缩或降解（Gao and Xu, 2025, Han et al., 2023）。这对于伤口愈合特别有帮助，因为慢性伤口通常具有碱性 pH 值，而健康皮肤则略带酸性。当局部 pH 值发生变化时，pH 响应性水凝胶可以释放其货物（如药物、外泌体），提供按需、针对伤口的治疗（Gao and Xu, 2025, Han et al., 2023）。

特别是，壳聚糖是一种主要通过碱性条件下几丁质的 N-去乙酰化衍生的多糖，具有固有的抗菌、抗炎和止血特性（Liu et al., 2022, Lv et al., 2024）。此外，壳聚糖中的胺基在 pH 6.3 以下可迅速转化为铵基，使壳聚糖成为生产 pH 响应性凝胶的合适选择（Pellá et al., 2018）。基于壳聚糖的伤口敷料可刺激血小板聚集和血块形成，抑制细菌生长，并促进肉芽组织形成（Feng et al., 2021）。此外，它是可生物降解且具有生物相容性的。PVP 是一种高度生物相容且水溶性的合成聚合物；基于 PVP 的水凝胶是成熟的伤口敷料，因为它们无毒、无免疫原性、透明且具有粘附性（Pérez-Garibay et al., 2025）。作为皮肤 ECM 的固有成分，HA 既贡献了粘弹性性质，又保留了水分。在水凝胶中，HA 促进角质形成细胞和成纤维细胞的生长，促进血管生成，吸收液体，并有助于维持湿润环境（Antoszewska et al., 2024）。既作为乳化剂又作为保湿剂，甘油增强了凝胶的弹性和水分保留。当结合使用时，壳聚糖/PVP/HA/甘油水凝胶形成多孔、柔性的伤口敷料，有效粘附于损伤部位，抑制感染，并提供持续释放的框架。

研究表明，壳聚糖/HA 复合水凝胶促进细胞粘附和生长，并在体内加速上皮伤口闭合（Antoszewska et al., 2024, ?alva et al., 2023）。此外，掺入 PVP 在不损害生物相容性的情况下改善了水凝胶的机械性能和整体性能（Pérez-Garibay et al., 2025）。

总之，基于壳聚糖的水凝胶已广泛用于伤口愈合应用，主要归功于其生物相容性、可生物降解性和成本效益。尽管以前曾报道过二元壳聚糖基水凝胶和化学交联的外泌体负载水凝胶系统（Che et al., 2024, Pellá et al., 2018, ?alva et al., 2023, Xiong et al., 2024），据我们所知，没有研究具体描述过一种包含壳聚糖、PVP、HA 和甘油的四组分系统，作为一种统一的、物理交联的、pH 响应性的且成本效益高的水凝胶基质，用于伤口愈合应用。将强效的胎儿组织来源外泌体和褪黑素整合并嵌入生物相容性水凝胶中，影响多种作用途径。外泌体介导的递送确保生长因子和褪黑素的集中、延长释放，而水凝胶维持有利于伤口愈合的环境（方案 1）。在本研究中，我们研究了一种创新的水凝胶，由壳聚糖、PVP、HA 和甘油组成，并与负载褪黑素的胎儿组织来源外泌体整合。我们假设该制剂将显著加速大鼠全皮层皮肤伤口的修复过程（方案 2）。目标是开发一种先进的伤口敷料，通过将胎儿组织来源外泌体和褪黑素的独特生物功能与我们复合凝胶的有利物理化学性质相结合，提供最佳的治疗效果。

章节片段
材料
壳聚糖（低分子量，160 kDa，脱乙酰度 75–85%）、褪黑素、聚乙烯吡咯烷酮 K 30 (PVP)、透明质酸 (HA，平均分子量 25 kDa)、Amicon 过滤器 100 kDa、MTT (3-(4,5-二甲基噻唑 -2- 基)-2,5-二苯基四唑溴化物) **(M 2128) 和 BSA（牛血清白蛋白）购自 Sigma-Aldrich。甘油、HCl、聚乙二醇 4000 (PEG) 和乙醇购自 Merck。磷酸盐缓冲液 (PBS) 片、胎牛血清 (FBS)、青霉素 - 链霉素

外泌体表征
为了验证外泌体的成功纯化，进行了针对 TSG101 和 CD63 的 Western 印迹分析。基于图 1A 所示的电泳结果，凝胶显示了两个主要标志物（TSG101: 45 kDa 和 CD63: 30 kDa），验证了胎儿组织来源外泌体的有效分离（Wu et al., 2024a）。此外，钙联蛋白：90 kDa（一种常规用作负外泌体标志的内质网驻留蛋白）的缺失证实了我们的囊泡

结论
总之，我们的混合敷料是一种多功能伤口支架，由负载褪黑素的胎儿组织来源外泌体和壳聚糖/PVP/HA/甘油水凝胶制成。分离出的外泌体被验证为具有典型特征的传统纳米级囊泡（约 61 纳米），并有效地与褪黑素包裹在一起。当在混合聚合物网络中达到生理 pH 值时，水凝胶从溶胶状态转变为凝胶状态。这种转变导致了

局限性
本研究有几个值得考虑的局限性。首先，尽管观察到 MEL@EXO 水凝胶改善了伤口愈合效果被归因于褪黑素和外泌体之间的协同作用，但在体内研究中未包括使用游离褪黑素溶液或直接将褪黑素掺入水凝胶中而不进行外泌体包裹处理的对照组。未来研究中加入这些比较组将使更精确

CRediT 作者贡献声明
Azar M. Bazzaz：撰写 – 初稿，调查。Alireza Karimi：撰写 – 初稿，调查。Ali Khoshnood：撰写 – 审阅与编辑，调查。Seyedeh Zeinab Jafari：撰写 – 审阅与编辑，调查。Maryam M. Matin：撰写 – 审阅与编辑，资源。Ahmad Reza Bahrami：撰写 – 审阅与编辑，资源。Elnaz Yaghoobi：撰写 – 审阅与编辑，方法学。Mona Alibolandi：撰写 – 审阅与编辑，形式分析。Mohammad Ramezani：撰写

利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被视为影响了本报告中所述的工作。

致谢
本研究的资金支持由马斯哈德医科大学（资助编号：4040867）和马什哈德费尔多西大学提供。

Azar M. Bazzaz|Alireza Karimi|Ali Khoshnood|Seyedeh Zeinab Jafari|Maryam M. Matin|Ahmad Reza Bahrami|Elnaz Yaghoobi|Mona Alibolandi|Mohammad Ramezani|Khalil Abnous|Seyed Mohammad Taghdisi