通过天然生物碱-抗菌剂协同作用增强抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌光动力灭活

《Journal of Materials Chemistry B》：Enhancing antimicrobial photodynamic inactivation through natural alkaloid–antiseptic synergy against methicillin-resistant Staphylococcus aureusOpen Access

　　

慢性伤口感染是一个重大的医疗保健挑战，尤其是随着抗生素耐药性的持续上升。抗菌光动力灭活（aPDI）是一种局部的、非抗生素的方法，其中光激活的光敏剂（PSs）产生活性氧（ROS），损伤细菌的基本结构。天然光敏剂，包括哈尔明碱（HA）、核黄素5′-磷酸（RB）、巴马汀（PM）和阿魏酸（FA），因其生物活性和光反应性而受到关注。本研究首次探讨了将这些天然光敏剂与膜活性抗菌剂奥替尼啶二盐酸盐（OCT）、聚六亚甲基双胍（PHMB）和过氧化氢（H₂O₂）联合使用，以提高对从糖尿病足溃疡中分离的临床金黄色葡萄球菌菌株（MJMC568-B）的aPDI疗效。通过肉汤微量稀释法（最低抑菌浓度和最低杀菌浓度（MIC/MBC）测定）、棋盘法和纸片扩散法评估了光敏剂和抗菌剂单独及联合的抗菌活性。除RB外，所有光敏剂均表现出内在抗菌活性，且在非辐照条件下大多数组合表现为无差异。使用420 nm LED（30 mW cm^?2；9.23–27.68 J cm^?2）对RB和PM进行光动力活性评估，使用365 nm（5.5 mW cm^?2；4.95–19.90 J cm^?2）对HA和FA进行评估。光活化后，特定的光敏剂-抗菌剂组合在低于各自MBC的浓度下实现了完全的细菌灭活（可培养性降低约8 log（CFU mL^?1））：HA（100 μg mL^?1）-OCT（0.489–0.978 μg mL^?1）和HA（25 μg mL^?1）-PHMB（7.81 μg mL^?1）在18.45 J cm^?2下，以及PM（200 μg mL^?1）-OCT（1.955 μg mL^?1）在19.90 J cm^?2下。基于FA的组合在辐照时未达到杀菌效果。ROS生成能力使用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）评估，单线态氧产生使用9,10-蒽二基-双（亚甲基）二丙二酸（ADMA）评估，结果表明当细菌悬浮液被辐照时氧化应激增加，并具有产生单线态氧的能力。总体而言，HA和PM在光动力激活下显著增强了OCT和PHMB的抗菌性能，实现了对金黄色葡萄球菌的完全灭活。这些发现突出了光敏剂-抗菌剂组合作为一种有前景的非抗生素策略用于慢性伤口管理，同时降低了所需的光敏剂和抗菌剂浓度。

**论文解读：基于天然生物碱与抗菌剂协同增强aPDI抗MRSA的研究**

**研究背景与问题**
慢性伤口感染是全球 healthcare 领域的重大挑战，约影响8300万人，且随着抗生素耐药性（AMR）的持续上升，传统抗生素治疗面临瓶颈。慢性伤口（如糖尿病足溃疡）常因持续炎症、微生物定植和生物膜形成而难以愈合，标准处理需通过清创和抗感染干预降低微生物负荷。然而局部抗生素因穿透性差、易诱导耐药和致敏风险而受限；常用抗菌剂如奥替尼啶二盐酸盐（OCT）、聚六亚甲基双胍（PHMB）和过氧化氢（H₂O₂）虽广泛用于伤口管理，但其细胞毒性及H₂O₂的愈合延迟效应仍令人担忧。抗菌光动力灭活（aPDI）作为一种非抗生素、多靶点的局部治疗策略，通过光激活光敏剂（PS）产生活性氧（ROS）和单线态氧（¹O₂）杀灭细菌，不易产生耐药性。天然PS（如哈尔明碱HA、核黄素5′-磷酸RB、巴马汀PM、阿魏酸FA）具有生物相容性好、可持续性高等优点，但单独应用时抗菌效果有限。将天然PS与膜活性抗菌剂联用，可能通过协同作用在降低各组分剂量的同时提高杀菌效率，但此前尚无系统研究。因此，研究人员首次探索了天然PS与OCT、PHMB、H₂O₂联合用于aPDI的潜力，以期为慢性伤口抗感染提供更安全有效的非抗生素策略。

**研究内容与主要结论**
该研究以从糖尿病足溃疡中分离的临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株MJMC568-B为模型，系统评估了四种天然PS（HA、RB、PM、FA）与三种抗菌剂（OCT、PHMB、H₂O₂）单独及联合的抗菌活性。研究发现，除RB外，HA、PM、FA均表现出内在抗菌活性（MIC分别为200、800、2000 μg mL^?1），而OCT和PHMB的MIC分别为3.91和250 μg mL^?1，H₂O₂则需高达35000 μg mL^?1。非辐照条件下的棋盘分析（FICI）显示大多数组合为无差异，但最低杀菌浓度（MBC）测定表明HA和PM联合可降低PS和抗菌剂的MBC。在光动力实验中，单独照射PS仅产生中等效果（最大降低2.7–3.71 log(CFU mL^?1)），而特定组合在显著低于各自MBC的浓度下实现了完全灭活（约8 log(CFU mL^?1)降低），包括HA（100 μg mL^?1）+OCT（0.489–0.978 μg mL^?1）、HA（25 μg mL^?1）+PHMB（7.81 μg mL^?1）在365 nm辐照（18.45 J cm^?2）下，以及PM（200 μg mL^?1）+OCT（1.955 μg mL^?1）在420 nm辐照（19.90 J cm^?2）下。FA组合未达到杀菌效果。通过DCFH-DA和ADMA探针检测，HA和PM组合能够产生ROS和单线态氧，且氧化应激水平显著高于单独化合物。该研究首次证明天然PS与抗菌剂的光动力协同可大幅降低所需剂量，为慢性伤口管理提供了新思路，论文发表于《Journal of Materials Chemistry B》。

**关键技术方法**
研究人员采用肉汤微量稀释法测定MIC/MBC；纸片扩散法（DDA）和棋盘法（CKB）结合Combenefit软件（Bliss模型）评估联合效应；使用自建LED阵列（365 nm和420 nm）进行光动力辐照；通过DCFH-DA荧光探针和alamar blue（AB）法分别检测ROS生成和代谢活性；采用ADMA探针测定单线态氧产生。临床菌株MJMC568-B源自葡萄牙Trás-os-Montes e Alto Douro中心医院糖尿病足溃疡，经16S rRNA测序鉴定。

**结果与讨论**

**3.1 无辐照条件下天然PS和抗菌剂的抗菌活性**
**3.1.1 PS和抗菌剂单独抗菌效果**
MIC测定显示，HA活性最强（MIC=200 μg mL^?1），PM次之（800 μg mL^?1），FA较弱（2000 μg mL^?1），RB在测试浓度内无MIC。抗菌剂中OCT活性最高（3.91 μg mL^?1），PHMB次之（250 μg mL^?1），H₂O₂仅在高浓度（35000 μg mL^?1）有效。文献对比显示MIC差异与菌株特性和方法学有关。

**3.1.2 PS-抗菌剂联合抗菌效果**
DDA定性筛选发现，RB-H₂O₂组合的抑菌圈增加最显著（+24.75 mm），HA-PHMB也显示出增效；但CKB定量分析（FICI）显示所有组合均为无差异（0.5–4）。MBC测定表明HA和PM联合能降低部分组分的MBC，提示在无辐照下也存在一定杀菌增强潜力。H₂O₂因CKB中出现拮抗/无差异且细胞毒性高，被排除在后续光动力实验之外。

**3.2 抗菌光动力疗效**
**3.2.1 天然PS的光动力活性**
HA在365 nm、19.80 J cm^?2下，250 μg mL^?1时获得最大3.71 log(CFU mL^?1)降低；FA在2000 μg mL^?1时降低3.26 log；PM在420 nm、27.68 J cm^?2下，800 μg mL^?1时降低2.70 log；RB在所有条件下均无光动力杀菌作用，因此后续组合实验排除RB。

**3.2.2 PS-抗菌剂组合的光动力活性**
HA-OCT组合在100 μg mL^?1 HA + 0.489–0.978 μg mL^?1 OCT、18.45 J cm^?2下实现完全灭活；HA-PHMB组合在25 μg mL^?1 HA + 7.81 μg mL^?1 PHMB下达到完全灭活；PM-OCT组合在200 μg mL^?1 PM + 1.955 μg mL^?1 OCT下实现完全灭活。FA与OCT/PHMB组合均未达到杀菌效果。此外，OCT和PHMB在辐照下自身抗菌活性显著增强，提示其存在未被认识的光依赖性行为。

**3.2.3 PS-抗菌剂组合的ROS生成能力**
利用DCFH-DA和AB法评估ROS生成。PM-OCT和HA-OCT组合在辐照后产生显著高于单独化合物和未辐照组合的氧化应激（以DCF/AB比值表示），表明这些组合通过增强ROS介导的损伤实现光动力增效。HA-PHMB组合的ROS水平较低，其损伤可能主要不依赖ROS。

**3.3 PS-抗菌剂组合的单线态氧生成能力**
ADMA实验显示，HA（100 μg mL^?1）和PM（200 μg mL^?1）在辐照条件下均能产生单线态氧，HA呈浓度和光照依赖性，PM虽有一定信号但未显示光照依赖性。OCT在1.955 μg mL^?1时也检测到非光照依赖的单线态氧产生，而PHMB和OCT在组合中不额外增加单线态氧产量。这表明组合增效可能通过其他光依赖机制（如光敏化膜破坏）而非单线态氧直接生成。

**讨论与结论**
该研究证实，天然PS（HA、PM）与膜活性抗菌剂（OCT、PHMB）的联合光动力处理能够显著增强对临床MRSA菌株的灭活效果，在远低于单独MBC的浓度下实现完全杀菌，同时可降低所需光剂量。这种协同作用可能源于抗菌剂破坏细菌膜结构，增强PS进入胞内靶点的能力，并辅以光照引发的ROS和单线态氧损伤。研究中还意外发现OCT和PHMB本身具有光照增强活性，为抗菌剂的光敏化应用提供了新视角。结论强调，天然PS与抗菌剂组合为慢性伤口感染提供了一种有前景的非抗生素策略，可减少药物剂量和光毒性风险。未来工作将聚焦于多菌种生物膜模型验证及皮肤细胞相容性评估，以推动其临床转化。