可注射噬菌体负载丝素微粒实现高效肿瘤免疫治疗

《Journal of Materials Chemistry B》：Injectable phage-loaded silk microparticles achieve efficient tumor immunotherapyOpen Access

　　

肿瘤免疫治疗因其能够激活免疫系统靶向攻击癌细胞而备受关注。然而，免疫治疗的临床疗效常常受到药物快速清除及肿瘤部位滞留不足的限制。在此，研究人员将丝素蛋白微粒（silk fibroin microparticles, SMPs）这一生物相容性药物载体与一种在侧壁展示PD-L1结合肽以阻断PD-1/PD-L1免疫检查点的PD-L1结合噬菌体（HH phage）相结合，克服了这一挑战。该组合旨在增强瘤内药物滞留并改善肿瘤治疗。简而言之，研究人员通过静电吸附将工程化噬菌体功能化修饰至丝素蛋白微粒（SMPs）上，生成HH-SMPs。瘤内注射后，HH-SMPs能够实现治疗性噬菌体的可控持续释放，从而促进有效的肿瘤治疗。与快速清除的游离HH噬菌体相比，该递送系统显著提高了肿瘤内噬菌体的局部浓度，并大幅延长了其瘤内滞留时间。因此，HH-SMPs在体内对LLC肿瘤表现出显著增强的肿瘤抑制效果。此外，HH-SMPs在细胞培养和动物体内均表现出良好的生物相容性。该研究表明，HH-SMPs递送系统为改善癌症治疗疗效提供了一种有前景的策略。

恶性肿瘤是临床上最具挑战性的疾病之一，传统疗法包括化疗、放疗和手术，但其固有缺陷仍限制患者生存。近年来肿瘤免疫治疗进展迅速，免疫检查点阻断在多种癌症中显示出潜力。PD-1/PD-L1轴是关键的免疫检查点，肿瘤细胞通过高表达PD-L1与T细胞表面PD-1结合，实现免疫逃逸。阻断这一相互作用可激活抗肿瘤免疫。然而，免疫检查点阻断疗法的临床效果常因药物在体内快速清除、肿瘤部位有效浓度不足而受限。因此，构建具有可控缓释能力的药物递送载体至关重要。丝素蛋白（silk fibroin, SF）是来源于蚕茧的天然高分子，其微粒（silk fibroin microparticles, SMPs）具有良好生物相容性、可降解性和药物保护能力。本研究将侧壁展示PD-L1结合肽HWFHRHH（HH）的工程噬菌体（HH phage）通过静电吸附负载于PEI修饰的SMPs，形成HH-SMPs，旨在延长噬菌体瘤内滞留并增强免疫治疗。相关成果发表于《Journal of Materials Chemistry B》。

研究人员采用的主要技术方法包括：噬菌体展示技术构建HH噬菌体；冷冻-解冻法制备SMPs；聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）表面修饰后静电吸附负载噬菌体；利用透射电镜、扫描电镜、Zeta电位、X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱、紫外-可见光谱及激光共聚焦显微镜进行理化表征；采用CCK-8、活/死染色、溶血实验评估体外生物相容性；在C57BL/6小鼠皮下接种Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma, LLC）细胞建立肿瘤模型，通过瘤内注射治疗，并以组织学染色、流式细胞术和免疫荧光分析疗效与机制。

3.1 噬菌体与SMPs的基本表征：透射电镜显示HH噬菌体为宽约7 nm、长约500 nm的纳米纤维；扫描电镜显示SMPs为球形、表面粗糙，平均粒径1.43 μm。Zeta电位证实SMPs和噬菌体均带负电，经PEI修饰后表面电位升至+26 mV，负载HH噬菌体后降至?15 mV，表明噬菌体成功吸附。

3.2 HH噬菌体的功能及其在SMPs上的负载：通过FITC标记和共聚焦显微镜观察到红色PEI与绿色噬菌体同时存在于SMPs表面，证明高效负载；定量分析显示在投入浓度10¹² pfu mL^?1时，每毫克SMPs可吸附约2.1×10¹¹ pfu噬菌体。释放实验显示初期快速释放后转为持续缓释。免疫荧光实验显示FITC标记的HH噬菌体可特异性结合LLC细胞表面，而野生型噬菌体无结合信号。

3.3 体外生物相容性：活/死染色和CCK-8实验显示HH-SMPs在0–300 μg mL^?1浓度范围内对L929、LLC及T细胞无明显细胞毒性；溶血率低于1%，表明材料具有良好的血液相容性。

3.4 HH-SMPs在肿瘤组织中的长期滞留及SMPs降解：活体成像显示，瘤内注射HH-SMPs后荧光信号持续至24 h，而游离HH噬菌体在4 h内基本清除；离体肿瘤成像进一步确认其滞留效果。降解实验显示SMPs在蛋白酶E溶液中呈浓度和时间依赖性降解，且24 h后荧光信号主要分布于肝脏，提示其通过肝代谢。

3.5 体内肺癌免疫治疗：在LLC皮下瘤模型中，HH-SMPs治疗组肿瘤生长抑制最显著，肿瘤重量最小；H&E染色显示明显肿瘤损伤，TUNEL凋亡信号增强，Ki67增殖信号减弱。CD4⁺和CD8⁺ T细胞免疫荧光显示HH-SMPs组浸润显著增多，同时IFN-γ和TNF-α水平升高，巨噬细胞M1型标志物iNOS上调、M2型标志物CD206下调，表明其重塑肿瘤免疫微环境。治疗期间小鼠体重稳定，血常规及肝肾功能指标无异常，主要器官H&E染色未见明显损伤。

讨论部分指出，HH-SMPs通过丝素蛋白载体的缓释作用，有效延长了工程噬菌体在肿瘤内的滞留时间，维持了局部有效浓度，从而增强PD-1/PD-L1阻断效果，促进CD8⁺ T细胞浸润和M1型巨噬细胞极化，最终提高抗肿瘤疗效，且安全性良好。研究结论：研究人员通过静电吸附成功制备了负载HH噬菌体的SMPs（HH-SMPs）。HH噬菌体在pVIII衣壳蛋白上展示PD-L1结合肽，可有效阻断PD-1/PD-L1相互作用并激活免疫细胞。SMPs赋予系统良好生物相容性和高效负载能力，实现噬菌体可控释放、延长瘤内滞留并显著增强抗肿瘤效果。体外和体内实验均证实其生物安全性和抗肿瘤性能，表明HH-SMPs是一种有前景的肿瘤免疫治疗材料，具有进一步临床转化潜力；但本研究未系统评估抗转移能力，未来需在转移模型中进一步验证，该平台有望用于多种实体瘤。