黏弹性依赖的、基于形变用顺序分叉对微凝胶进行分选

《Lab on a Chip》：Viscoelasticity-dependent, deformation-based sorting of microgels using sequential bifurcationsOpen Access

　　

液滴微流控（droplet-based microfluidics）通过把反应体系微型化，加速了在大型组合蛋白文库中发现稀有变异，但通量限制与检测兼容性限制了可访问序列空间及可用于液滴筛选的酶种类。被动、基于可变形性（deformability）的分选系统可通过微流控并行化扩展规模，但现有平台缺乏高效探索巨大适应度地形所需的灵敏度与通量。研究人员提出一种微流控器件，利用顺序分叉（sequential bifurcations）按可变形性被动分选单分散微凝胶（monodisperse microgels），通量可达300 Hz。T形结中的伸长主导流（extension-dominated flow）使微凝胶快速形变，并在有限流动惯性（finite flow inertia）下产生黏弹性依赖轨迹。研究人员用琼脂糖微凝胶模型表征其转运动力学，能以99.3%准确率把高黏度琼脂酶降解微凝胶与高弹性1%琼脂糖微凝胶快速分离。该设计有望拓展液滴筛选在酶介导聚合或降解检测中的能力。

研究背景方面，液滴微流控（droplet-based microfluidics）已实现高通量筛选（high-throughput screening，HTS），用于微生物活性检测、药物发现和酶定向进化。液滴把细胞与生物分子分隔进皮升至纳升级体积，较机器人微孔板法大幅降低试剂消耗、筛选时间与成本。典型液滴筛选每轮约筛10⁸变异，但相对于10¹²量级文库仅采样0.01%，发现最优变异概率低。主动分选依赖荧光等光学信号加外场驱动，虽可同步检测与分选，但每个通道都需激光、物镜、探测器与控制电子件，难以芯片内大规模并行。被动分选仅靠通道几何与水动力，按尺寸或机械性质分离，无需检测与驱动仪器，适合并行放大；但已有基于沟槽（grooves）或惯性升力（inertial lift）的形变分选要么需低速捕获、要么需长通道聚焦，存在灵敏度不足、通量低的问题。因此，研究人员开展本研究，目标是用紧凑几何特征在高流速下诱导大形变，实现单分散微凝胶按黏弹性被动分选，并为酶介导水凝胶降解或聚合物解聚文库筛选提供平台。论文发表于《Lab on a Chip》。

主要关键技术方法上，研究人员采用芯片外并行阶梯乳化（step emulsification）生成直径87 μm、变异系数3%的单分散琼脂糖微凝胶；用应力控制流变仪测定宏观水凝胶储能模量G′；用COMSOL做三维层流稳态流场仿真，以无滑移边界与Re=100条件获得分叉区流线与分界流线（separatrix）；用5万帧每秒高速成像配合ImageJ与MATLAB提取微凝胶形貌、质心、速度与位移；用β-agarase I处理1%琼脂糖微凝胶得到酶降解样本，并以亮蓝染色区分降解与非降解群体进行混合分选验证。

2.1 Device design and working principle：研究人员设计DESMoS器件，含悬浮液入口、包被油（sheath oil）入口、直行输送通道、分选区与三出口；油鞘流比Q_oil/Q_susp>45使微凝胶在分选前拉开间距。分选区先由不对称T形结产生带驻点的伸长主导流，使微凝胶在毫秒内形变；随后扩张区接Y形结，按质心相对分界流线位置进入outlet 1或outlet 2，outlet 3排废油。通过出口管静水压可调节进入outlet 2的弹性阈值。

2.2 Characterization of the sorting mechanism：研究人员在Re=100下分别注入0.1%与1%琼脂糖微凝胶，定义形变参数D=1?C（C为圆度）。结果表明输送通道内两者形变差很小，但在T形结角点最大形变D_max出现在约0.32 ms，软凝胶形变明显更大；硬凝胶x方向速度在最大形变处近零，软凝胶仍保持较高x速度并伸入扩张区。以κ/w表示相对通道宽度的横向位移，软凝胶质心位于Y形结角点右侧进入outlet 2，硬凝胶在左侧进入outlet 1，证明T形结处形变诱导位移是分选主因。

2.3 Resolution of the sorting device：研究人员制备0.1%至1%琼脂糖微凝胶，发现D_max与特征位移(κ/w)^*均随弹性毛细数（elastic capillary number，Ca_e=μ_cε?/G）呈近似对数增长。0.1%与0.5%琼脂糖微凝胶特征位移无重叠，弹性模量差约100 Pa即可分辨；芯片计数显示0.1%和0.25%全部进outlet 2，1%中95%进outlet 1，0.5%与0.75%因Y形接触几何而呈随机分配。

2.4 Demonstration of enzyme-degraded microgel sorting：研究人员把β-agarase I降解的1%琼脂糖微凝胶与非降解微凝胶混合，以300 Hz注入。降解凝胶G′?1接近水状黏性流体并用亮蓝标记。结果显示outlet 1含0.14%降解与99.86%非降解，outlet 2含90.11%降解与9.89%非降解；以降解为正、非降解为负，准确率99.3%、灵敏度90.1%、特异性99.9%。错误主要来自重注时聚集、碎裂及未清空微凝胶间水动力干扰。

讨论部分中，研究人员指出DESMoS在有限惯性Re=100下以伸长主导流诱导快速大形变，较Re<1绕柱伸长流及沟槽式微凝胶分选通量更高，较惯性剪切流对黏弹性差异更敏感。被动结构可通过梯状阵列并行，单芯片排布超3500个分选单元理论上可超1 MHz，从而十多分钟筛10⁹变异；但并行需分布通道阻力远小于单元阻力、采用高层高分布通道或多层SU-8与3D打印、上游加流阻器、径向布阵防悬浮液末端堆积。该平台有望结合无细胞表达与粒径缩小，筛选水凝胶降解、酶交联、细胞外基质沉积与细胞重塑相关酶变异。

结论部分翻译：总之，研究人员提出一种集成微流控分叉的器件，以最高300 Hz通量按可变形性分选单分散微凝胶（345 pL，87 μm）。研究人员以琼脂糖为模型材料表征分选机制，并证明该方法可用于筛选琼脂酶降解微凝胶。这些器件可应对蛋白水解降解、酶促交联、细胞外基质沉积及细胞介导基质重塑等筛选挑战。