《Journal of Applied Poultry Research》：Recombinant
Limosilactobacillus reuteri strains expressing nanobodies against
Clostridium perfringens toxins improve broiler performance during subclinical necrotic enteritis challenge
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摘要
由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, Cp）毒素引起的亚临床坏死性肠炎（Subclinical Necrotic Enteritis, SNE）估计影响全球高达40%的商品肉鸡群，并因生产性能下降而导致重大经济损失。经工程
摘要
由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, Cp）毒素引起的亚临床坏死性肠炎（Subclinical Necrotic Enteritis, SNE）估计影响全球高达40%的商品肉鸡群，并因生产性能下降而导致重大经济损失。经工程改造的肠道源益生菌，例如表达针对病原体或病原毒素的纳米抗体（nanobodies, Nbs）的乳杆菌，正逐渐成为预防和治疗人类及动物疾病的有前景的替代方案。本研究评估了试验性兽药产品BE-101（该产品组合了两种分别表达针对Cpα毒素和NetB毒素纳米抗体的重组罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri, LR）载体）在SNE攻毒模型中对体重增重（body weight gain, BWG）、采食量（feed intake, FI）、饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）及死亡率的影响。该模型在商业化管理条件下使用2,600只雄性Ross 708肉鸡开展。与攻毒对照组相比，在为期43天的研究中，BE-101两剂方案（出壳日（day-of-hatch, DOH）粗喷雾及第14天经饮水给予）显著降低了4个点的FCR，BWG数值上提高了2.4%，总死亡率数值上降低了25%。仅出壳日给予的单剂方案对BWG（+1%）和FCR（-1个点）提供了部分益处，死亡率数值上降低了33%。不表达纳米抗体的骨架载体菌株仅提供了有限的益处。总体而言，这些结果表明，工程化益生乳杆菌表达毒素中和纳米抗体可增强益生菌本身的适度益处，并可能为减少商品肉鸡体系中SNE相关的生产损失提供一种实用方法。
**论文解读：表达抗产气荚膜梭菌毒素纳米抗体的重组罗伊氏乳杆菌对亚临床坏死性肠炎攻毒下肉鸡生产性能的改善**
**一、研究背景与问题提出**
坏死性肠炎（necrotic enteritis, NE）是由革兰氏阳性菌产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, Cp）分泌的毒素引起的家禽肠道疾病，可分为临床型（急性）和亚临床型。亚临床型坏死性肠炎（subclinical NE, SNE）虽不表现高死亡率，但因降低体重增重（body weight gain, BWG）、恶化饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）并可能增加屠宰废弃率，造成严重的经济损失。据估计，SNE影响全球高达40%的商品肉鸡群，年经济损失可达20亿美元。Cp定植于小肠黏膜后分泌多种毒素，其中α毒素（alpha-toxin）导致细胞裂解，NetB毒素通过形成细胞膜孔道损伤肠上皮细胞，二者共同驱动肠道炎症、坏死及相关生产性能损失。此外，Cp在肝脏的定植可引发胆管肝炎和坏死性肝炎，导致屠宰时废弃。尽管利用α毒素或NetB的无毒变异体进行免疫可提供部分保护，且联合两种抗原可增强保护效果，但由于抗毒素制剂需在复杂的禽类肠道环境中发挥作用并到达毒素释放的小肠部位，有效预防仍具挑战性。
随着许多地区对抗生素使用的限制，SNE的发病率有所上升，即使在死亡率不高的情况下也影响肉鸡生产力，部分原因可能是扰乱了包括乳杆菌在内的有益肠道菌群。作为抗生素的替代方案，益生菌及基于益生菌的递送系统在预防和缓解临床型及亚临床型NE方面显示出潜力。益生菌可限制包括Cp在内的肠道病原体定植，减少氧化损伤和肠上皮细胞凋亡，并增强肠道中病原特异性免疫球蛋白A（IgA）反应。在众多益生菌候选菌株中，乳杆菌兼具抗菌活性和对宿主生产性能的益处，其益生潜力与产生细菌素、乳酸和过氧化氢以及免疫调节作用有关。罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri, LR）是鸡小肠中最普遍且丰度最高的菌种之一，能在低pH、高胆汁和微氧至严格厌氧环境中存活，被认为是安全且天然的肠道益生菌。然而，在不表达特异性抗毒素分子的情况下，单独使用益生菌菌株对SNE的缓解作用相对有限。
为了将抗毒素制剂有效递送至小肠，纳米抗体（nanobodies, Nbs）成为有前景的候选分子。纳米抗体是自20世纪90年代发现以来备受关注的单域重链抗体，具有分子量小、稳定性高、抗原结合亲和力高、水溶性好及适合在微生物载体中表达等特性。通过在肠道内局部产生纳米抗体，可结合并中和分泌的毒素，阻断其与上皮细胞的相互作用，从而限制毒素介导的肠道损伤。以鸡肠道原生乳杆菌作为微生物载体，既能耐受上消化道恶劣条件并在肠道定植，又能将靶向分子直接递送至作用部位，是一种具有吸引力的口服生物治疗策略。
BiomEdit公司的研究人员先前已证明LR既可作为益生菌，也可作为递送抗毒力肠毒素和病原体纳米抗体的微生物载体。特别是，表达抗NetB纳米抗体的重组LR菌株LR NE06和表达抗α毒素纳米抗体的LR NE01，联合构成产品BE-101，在鸡只中显示出对Cp诱导的临床型NE的体内功效，并且美国农业部（USDA）有条件许可的关键笼养功效研究显示，与未处理攻毒对照组相比，BE-101使NE死亡率显著降低48.7%。基于这些发现，本研究在更贴近美国商品肉鸡生产环境的地面围栏饲养条件下，重点评估BE-101在SNE攻毒期间对生产性能的影响。
**二、研究目的**
本研究旨在评估试验性兽药产品BE-101（两种重组LR菌株的组合，分别表达抗Cpα毒素和NetB毒素的纳米抗体）在商业化管理条件下的SNE攻毒模型中，对肉鸡体重增重、采食量、饲料转化率及死亡率的影响。研究比较了两剂方案、单剂方案、抗生素对照组、骨架菌株对照组及未处理攻毒对照组的效果，以确定重组益生菌是否能够增强益生菌本身的适度益处，并为减少SNE相关生产损失提供实用方法。
**三、主要技术方法**
研究使用2,600只出壳日（day-of-hatch, DOH）雄性Ross 708雏鸡，随机分为5个处理组，每组520只，设20个重复栏。攻毒模型采用出壳日经粗喷雾给予球虫疫苗Coccivac? B52，随后在第15、16、17和28天通过饲料顶饰法给予Cp攻毒（CP6菌株，剂量为108 CFU/只）。BE-101经出壳日粗喷雾和/或第14天饮水给予。统计采用混合模型单因素方差分析（ANOVA），以处理为固定效应、栏位置为随机效应，FCRd考虑了死亡和淘汰导致的采食偏差。
**四、研究结果**
**1. 育雏期生产性能（第0至15天）**
在育雏期，各处理组间体重和BWG无显著差异。BE-101两个剂量组的采食量显著低于攻毒对照组3.8%；饲料效率（FCRa或FCRd）较攻毒对照组改善约6个点（P<0.05）。育雏期总体死亡率较低，但BE-101两剂组在数值上低于对照组（0.6% vs. 1.8%）。结果表明，BE-101在Cp攻毒前即改善了早期饲料效率。
**2. 生长期生产性能（第16至28天及累计第0至28天）**
16至28天期间，BE-101两剂组的BWG（0.800 kg）显著高于攻毒对照组（0.768 kg，P<0.05），增幅4.2%；累计至第28天的BWG也显著高于对照组3%。FCRd方面，BE-101两剂组（1.667）较对照组（1.762）显著改善近10个点。单剂方案也可改善FCRd（1.721），但未达显著水平。BMD和骨架菌株组与对照组表现相似。生长期是BE-101两剂方案优势最明显的阶段。
**3. 育成期及全程生产性能（第29至43天及第0至43天）**
29至43天，BE-101两剂组BWG在数值上高于对照组1.9%；第43天体重（2.693 kg）在数值上较对照组高2.4%，并显著高于BMD组和单剂组。全程（0至43天）FCRa和FCRd在BE-101两剂组中均为各处理最低，其中FCRa（1.632）较对照组（1.672）显著降低4个点。NE相关死亡率和总死亡率在各组间无显著差异，但BE-101各处理组在数值上均低于攻毒对照组。骨架菌株组也表现出数值上的死亡下降，但总体效果弱于BE-101。
**4. 总体生产性能**
在整个43天饲养期内，BE-101两剂方案持续产生最优结果，包括较高的体重、改善的饲料效率（FCRa和FCRd）以及数值上较低的NE死亡率。生长期的效果最大，与NE攻毒压力最高的时期一致。骨架菌株组表现出的适度益处提示乳杆菌本身的益生特性提供了一定改善，但BE-101的更强响应表明额外表达中和Cp毒素（NetB和α毒素）的纳米抗体赋予了超越骨架菌株的额外益处。单剂方案在育雏期有益，但在后期作用不明显，提示第14天的第二剂对于在生长期和育成期提供持续保护至关重要。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，FCRd在该试验中尤为信息丰富，因为它考虑了死亡、采样和淘汰对饲料效率的影响。FCRa与FCRd之间的差异凸显了早期鸡只死亡导致的低效性。BE-101在数值上降低了死亡率并改善了总体表现，使FCRd在攻毒模型中提供了更少偏倚、更具信息量的饲料效率度量。研究还回顾了益生菌（尤其是乳杆菌）在缓解慢性肠道损伤相关生产性能下降中的作用，但强调了本研究中骨架菌株的适度益处表明单靠益生菌作用有限。相比之下，BE-101的更强响应证实了工程化益生乳杆菌表达靶向生物活性分子可显著增强保护效果。该双重功能方法——结合益生菌活性与直接毒素中和作用——可能为商品肉鸡生产系统提供改善健康和性能的实用策略。对于致病性由α毒素或NetB之外毒素驱动的Cp菌株，可能需要构建针对这些毒素的新型LR组合以取得同等保护水平。
研究结论如下：
1. 在商业化管理环境中的温和NE攻毒模型下，BE-101改善了肉鸡生产性能并可能降低SNE相关死亡率。
2. BE-101两剂方案提供了最一致的益处，表明加强剂给药可增强保护并延长生产性能响应。
3. 骨架菌株效果有限，提示单独使用益生乳杆菌仅提供适度益处，而工程化表达抗NetB和α毒素纳米抗体可大幅增强功效。
4. 这些发现表明，重组益生乳杆菌可能为商业肉鸡体系提供一种实用的非抗生素替代方案，以替代常规饲用抗生素或益生菌，减少NE相关生产损失。
