内源性追踪揭示活细胞中磷脂酶C信号传导期间磷脂酸生成的旁系同源特异性靶点

《Journal of Biological Chemistry》：Endogenous tracking reveals paralog-specific targets for phosphatidic acid generation during phospholipase C signaling in living cells

　　

磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)是磷脂酶C(Phospholipase C, PLC)信号传导过程中产生的重要中间体，但其调控机制十分复杂。在哺乳动物中，PA可由十种不同的二酰甘油激酶(diacylglycerol kinase, DGK)旁系同源物和两种不同的磷脂酶D(phospholipase D, PLD)旁系同源物生成。由于这些酶在不同条件下及不同膜结构上被激活，理解各旁系同源物对PA生成的特异性贡献对于开发调节PLC通路的治疗药物至关重要。为此，研究人员旨在表征DGK抑制剂R59022和BMS-502对活细胞中单个内源性标记DGK旁系同源物的旁系同源特异性。研究发现，R59022和BMS-502均能将内源性DGKα招募至质膜，并在DGKα催化片段异位定位至线粒体外膜时抑制其活性。然而，在有效剂量下，R59022却矛盾地增加了PA水平，而BMS-502则表现为强效抑制剂。使用BMS-502结合内源性毒蕈碱受体的卡巴胆碱刺激进行的活细胞成像实验表明，在PLC激活过程中，必须同时抑制DGKα和PLD才能显著降低PA水平。这些发现既鉴定了调节PLC信号事件的旁系同源特异性可成药靶点，也建立了一个在活细胞中表征DGK和PLD活性的新平台。

磷脂酸(PA)是磷脂酶C(PLC)信号通路中的关键信号和代谢脂质。当PLC水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP₂)产生二酰甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP₃)后，PA在下游生成，对PIP₂的补充和质膜(PM)稳态维持至关重要。PA的产生可通过两条途径：DAG被二酰甘油激酶(DGK)磷酸化，或DAG和升高的Ca²⁺激活蛋白激酶C(PKC)后刺激磷脂酶D(PLD)水解磷脂酰胆碱(PC)生成PA。哺乳动物表达十种DGK旁系同源物和两种PLD旁系同源物，它们在多种条件下被激活，而特定旁系同源物在PLC通路中的具体作用尚不清楚。确定这些作用对于指导高血压、T细胞增殖等PA/DAG介导信号相关疾病的靶向治疗至关重要。然而，常用DGK抑制剂R59022的旁系同源选择性存在争议，且高剂量下可能矛盾地增加PA并引起细胞毒性。新发现的抑制剂BMS-502则显示出对DGKα、DGKζ和DGKι的纳摩尔级抑制活性。因此，研究人员旨在天然细胞环境中系统表征R59022和BMS-502对各个内源性标记DGK旁系同源物的效应，以解析DGK和PLD对PA水平的贡献。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

研究人员利用CRISPR/Cas9技术将荧光蛋白（NeonGreen或StayGold）敲入内源性DGK和PLD基因座，通过全内反射荧光(TIRF)显微镜和共聚焦显微镜实时追踪蛋白的质膜转位；采用化学诱导二聚化系统将DGKα催化结构域定位于线粒体外膜，结合PA生物传感器PILS-Nir1和DAG生物传感器C1ab-Prkd1定量脂质变化；并使用低微流靶向脂质组学分析脂质种类。细胞模型包括HEK293A及其衍生细胞系、HeLa和COS-7细胞。

### R59022对细胞有毒性并增加PA水平
研究人员用PILS-Nir1生物传感器观察急性刺激，发现50 μM R59022或等体积DMSO导致HEK293A细胞大量起泡、收缩和脱落，而存活细胞显示PA水平升高。用C1ab-Prkd1确认DAG积累，但PA也升高。在HeLa和COS-7细胞中，R59022同样诱导PA增加，但未见明显毒性。靶向脂质组学显示R59022显著上调不饱和DAG和饱和PA。这表明R59022在有效浓度下并非单纯抑制DGK，反而引发PA增加。

### R59022和BMS-502将内源性DGK招募至质膜
通过TIRF成像，50 μM R59022和1 μM BMS-502均导致DGKα、DGKθ和DGKζ的颗粒数量在质膜区域增加，其中DGKα招募最显著，且R59022的招募幅度大于BMS-502。该结果首次揭示R59022也能诱导DGK膜转位。

### R59022在微摩尔范围内招募DGKα至质膜并抑制其催化活性
剂量递增实验表明，R59022以剂量依赖方式招募NG-DGKα至质膜，其EC₅₀约为数十微摩尔。在线粒体化学诱导二聚化系统中，R59022抑制DGKα催化片段(FKBP-DGKα-cat)的活性，IC₅₀约为36.3 μM，与EC₅₀相近。然而，这些剂量伴随细胞形态损伤，说明R59022在活HEK293A细胞中不是安全有效的DGK抑制剂。

### BMS-502在纳摩尔范围内招募DGKα至质膜并抑制其催化活性
同样实验显示，BMS-502以剂量依赖方式招募NG-DGKα，并在线粒体测定中几乎完全抑制FKBP-DGKα-cat，其EC₅₀与IC₅₀均在约100 nM左右，且细胞保持正常形态。表明BMS-502是更优的DGKα抑制剂。

### DGKα和PLD活性对于PLC激活期间的PA产生都是必需的
用卡巴胆碱(CCh)激活内源性M3毒蕈碱受体以刺激PLC。单独预孵育BMS-502升高DAG但仅轻微降低PA；单独使用PLD抑制剂FIPI不影响DAG，但降低PA的初始产生速率，后期PA水平回升；同时使用BMS-502和FIPI则几乎完全消除PA产生。这表明在PLC信号中，PA生成需要DGK和PLD两条途径共同作用。

### PLC激活将DGKα招募至质膜，而PLD2与质膜基础结合
利用CRISPR标记PLD1和PLD2，共聚焦显示PLD1呈胞质定位，PLD2定位于质膜。TIRF定量显示静息状态下PLD2高度关联质膜，而CCh刺激后，仅DGKα被瞬时招募至质膜，峰值约135秒后回落；其他DGK和PLD无显著招募。这提示DGKα是PLC激活时响应PM招募的主要DGK。

讨论部分，研究人员提出模型，认为PLD2维持基础PA水平并在PLC激活早期贡献PA，DGKα则在被招募后于后期产生PA。R59022的矛盾效应可能源于其脱靶作用于PKC或其他激酶，或通过C1a结构域影响DGKα，但具体机制尚需进一步研究。该研究建立的基于内源性标记蛋白的活细胞成像平台，能够像体外生化实验一样绘制药物剂量-反应曲线，并有效区分DGK和PLD的旁系同源特异性贡献。同时，BMS-502在HEK293A细胞中有效且无毒，可用于解析PLC信号中的PA调控。这一平台有望推广至其他可成药脂质激酶的研究。结论：R59022因脱靶效应导致PA增加和细胞毒性，不宜作为活细胞DGK抑制剂；BMS-502是安全的DGKα抑制剂，且DGKα和PLD2是PLC激活时PA产生的关键旁系同源物。