《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Methanogenesis recovery from stagnant anaerobic digestion system under extreme acidic stress
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摘要挥发性脂肪酸的过度积累会显著抑制甲烷产生，最终导致产甲烷作用完全停止，这对厌氧消化（AD）系统构成了重大挑战。本研究中发现，在极端酸性胁迫下，液态和固态厌氧消化（LS-AD和SS-AD）系统的产甲烷作用在完全停止后均自发恢复。微生物群落分析显示，在长期酸抑制后微生物群落结
摘要
挥发性脂肪酸的过度积累会显著抑制甲烷产生，最终导致产甲烷作用完全停止，这对厌氧消化（AD）系统构成了重大挑战。本研究中发现，在极端酸性胁迫下，液态和固态厌氧消化（LS-AD和SS-AD）系统的产甲烷作用在完全停止后均自发恢复。微生物群落分析显示，在长期酸抑制后微生物群落结构发生了显著变化，并伴随着氢营养型产甲烷菌的富集。宏基因组结果表明，谷氨酸脱羧作用通过消耗胞内质子并维持胞内pH，是极端酸性胁迫下LS-AD和SS-AD产甲烷恢复的重要机制，这一结论进一步得到了谷氨酸脱羧酶验证实验的支持。此外，将过表达谷氨酸脱羧酶基因的基因工程大肠杆菌菌株引入AD系统以促进产甲烷恢复，该效应在SS-AD中更为显著，累计甲烷产量提高了24.9-56.8%。基于AD系统在极端酸性胁迫下的自调节能力，开发了一种接种物酸适应策略作为人工酸驯化的替代方案。经酸适应的接种物富含纤维素分解菌和氢营养型产甲烷菌，特别是HN-HF0106和地窖甲烷球菌。与未经适应的接种物相比，经酸适应的接种物促进了LS-AD中的产甲烷恢复，并使LS-AD和SS-AD的累计甲烷产量分别提高了42.1%和11.3%。本研究为极端酸性胁迫下的产甲烷恢复机制提供了新的见解，并为高效AD策略的开发提供了支持。
引言
厌氧消化（AD）能够同时实现有机废弃物的处理和通过沼气生产回收可再生能源[1]、[2]、[3]。高碳含量的农业废弃物通过AD具有可观的甲烷生产潜力。然而，其较高的碳氮比（C/N）可能导致氮限制和缓冲能力降低，从而增加与挥发性脂肪酸（VFA）积累相关的酸化风险。AD过程中VFA的过度积累会降低pH值，抑制产甲烷活性，损害反应器性能，可能导致甲烷生产的完全停止[4]。AD的稳定运行依赖于微生物群落的功能协调及其成员间有效的共生作用[5]。这种平衡的破坏会损害AD的整体性能。产甲烷古菌对pH的要求比发酵菌更为严格，对酸性条件的耐受性较差[6]。在底物快速水解和产酸阶段，VFA的生成速度可能超过其消耗速度，导致pH急剧下降。由此产生的酸化抑制了产甲烷活性，进一步破坏了VFA产生与消耗之间的平衡[7]、[8]。因此，VFA积累及相关的酸化仍然是AD稳定运行和工业化应用的主要障碍。
近期研究探讨了多种防止酸抑制的方法，如与富氮原料共消化[9]、[10]、用碱性试剂调节pH[11]、添加导电材料[12]、[13]、微曝气[14]、添加微量元素[15]、[16]以及生物强化[17]。不幸的是，这些策略存在一些缺点，例如碱性添加剂引入的Na+和Ca2+离子可能抑制微生物细胞活性，导电材料难以回收且成本增加。同时，关于AD的研究也探索了极端酸性环境中产甲烷的耐受和适应机制。此前的研究表明，对严重酸化的适应涉及显著的微生物群落重构，其特征为乙酸营养型产甲烷菌减少、氢营养型和代谢多样的产甲烷菌富集，以及在pH 5.5下能够长期存活的耐酸产甲烷菌群的筛选[18]、[19]。梭菌属、甲烷假单胞菌和甲烷短杆菌在由高乙酸浓度引起的抑制后产甲烷恢复中的作用，进一步证明了微生物的适应与恢复能力[1]。此前的研究主要关注酸抑制下产甲烷性能的恶化，而非产甲烷完全停止后AD系统的恢复[13]。因此，实际AD过程中在产甲烷完全停止后是否能够自发恢复产甲烷活性仍不清楚。此外，虽然酸抑制下AD中的代谢途径转化和关键功能菌群已被研究，但主要集中在模型底物而非天然原料上[18]、[20]。这些局限性限制了现有研究成果对实际AD工程的直接应用。
本研究探讨了在玉米秸秆液态和固态厌氧消化（LS-AD和SS-AD）中极端酸性胁迫下的产甲烷停止与恢复。通过16S rRNA扩增子测序和宏基因组学，基于AD性能、微生物群落结构和代谢途径的变化分析了产甲烷恢复过程。随后，通过添加关键酶进一步验证了宏基因组结果。构建了工程菌株并提出了新的酸驯化策略以提高能源转化效率。本研究为产甲烷恢复机制提供了新的见解，并为恢复受酸抑制影响的AD系统提供了实用策略。
章节摘要
玉米秸秆与接种物
风干玉米秸秆采自中国江苏省连云港市，经研磨后过0.85毫米筛网。牛粪按1:3的质量比与水稀释制备接种物，并在25 °C下培养30天以减少残余可生物降解有机物。为确保接种物活性一致，每次AD实验前均按上述方法重新培养接种物。每次AD实验所用玉米秸秆和接种物的特性
极端酸性胁迫下厌氧消化中产甲烷的自发恢复
从第2天起，LS-AD和SS-AD中的产甲烷作用均停滞，伴随pH迅速下降至6.0以下以及VFA积累（图2），表明两个系统均遭受了极端酸性胁迫。然而，甲烷生产分别在LS-AD第30天和SS-AD第32天恢复，表明AD系统具有一定的自调节能力。与LS-AD相比，SS-AD经历了更长的抑制期，但表现出更高的甲烷产量和
讨论
在本研究中，令人意外地发现AD系统在因极端酸抑制导致产气停止后，经过一段时间能够自发恢复产甲烷作用。这一现象表明AD具有一定的自调节能力。VFA的积累抑制了底物的降解，并刺激了AD过程中细菌和古菌的结构转变。基于16S rRNA扩增子测序的结果，产甲烷恢复主要依赖于
结论
在本研究中，令人意外地发现AD系统即使在长期极端酸抑制导致产甲烷停止后，仍能自发恢复甲烷生产。产甲烷恢复主要依赖于氢营养型产甲烷菌。谷氨酸脱羧作用被确定为极端酸性胁迫下AD产甲烷恢复的重要自调节机制。无论是过表达gad的工程菌株还是经酸适应的消化液（作为
CRediT作者贡献声明
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利益冲突声明
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致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2024YFD1700500）、陕西青年****项目（A279021901）、陕西省重点研发计划（2024CY2-GJHX-74）、中央高校基本科研业务费专项资金（2452021112）、深圳市自然科学基金（JCYJ20220530161408019）、广东省高校创新团队计划项目（2023KCXTD038）、煤炭高效利用与绿色发展国家重点实验室基金等的资助。
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