Bushen-Yizhi方剂通过激活在伊博妥酸诱导的小鼠体内的ST8Sia Ⅱ/Ⅳ-PSA-NCAM通路来促进神经发生并改善认知障碍

《Journal of Ethnopharmacology》：Bushen-Yizhi formula promotes neurogenesis and ameliorates cognitive impairment by activating ST8Sia Ⅱ/Ⅳ-PSA-NCAM pathway in ibotenic acid induced mice

　　摘要
民族药理学相关性
Bushen-Yizhi 方剂（BSYZ）是一种传统的中药方剂，被广泛用于治疗肾虚综合征和缓解与阿尔茨海默病（AD）相关的认知障碍。神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）的多聚唾液酸化的丧失与认知功能障碍密切相关。然而，BSYZ 是否调节 PSA-NCAM 的多聚唾液酸化及其潜在机制仍不清楚。

研究目的
本研究旨在探讨 BSYZ 是否通过激活 ST8Sia II/IV-PSA-NCAM 通路来促进海马神经发生并改善认知障碍。

方法
通过向 C57BL/6 小鼠的基底核中双侧注射伊博碱（IBO）建立类似 AD 的小鼠模型。动物被随机分为五组：对照组、模型组、低剂量 BSYZ 组（1.46 g/kg）、高剂量 BSYZ 组（5.84 g/kg）和多奈哌齐组（3 mg/kg）。使用开放场试验（OFT）、新物体识别试验（NORT）和 Morris 水迷宫（MWM）评估认知功能。通过免疫荧光染色评估海马区 PSA-NCAM 的表达，并结合网络药理学进一步研究。通过盐酸水解后进行 4,5-二甲基二氧-1,2-苯二胺二盐酸盐（DMB）衍生化结合质谱法定量 PSA-NCAM 相关的多聚唾液酸水平。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和 Western blotting 确定 α-2,8-唾液酸转移酶 II 和 IV（ST8Sia II/IV）的 mRNA 和蛋白质表达水平。通过免疫荧光双标记评估海马神经发生。使用 HPLC-Q-TOF MS/MS 识别针对 ST8Sia II/IV 的生物活性化合物，随后进行分子对接和分子动力学模拟以预测其结合亲和力。

结果
IBO 诱导的小鼠模型表现出显著的认知缺陷，证实了模型的成功建立。行为评估显示，低剂量和高剂量 BSYZ 显著改善了学习和记忆表现。蛋白质组学分析和免疫荧光染色显示，BSYZ 显著增加了海马区 PSA-NCAM 的表达（**P < 0.01, n = 5）。定量分析进一步显示，低剂量和高剂量 BSYZ 治疗后 PSA-NCAM 相关的多聚唾液酸水平分别增加了 78%（*P < 0.05, n = 5）和 102%（**P < 0.01, n = 5）。BSYZ 显著增加了海马齿状回中的 PSA-NCAM+/DCX+ 细胞数量（*P < 0.05），同时 Nestin+/BrdU+（*P < 0.05）、DCX+/BrdU+（**P < 0.01）和 NeuN+/BrdU+（**P < 0.01）双阳性细胞也显著增加，表明神经发生和神经元成熟得到增强。此外，BSYZ 显著上调了海马区 ST8Sia II（**P < 0.01）和 ST8Sia IV（**P < 0.01）的 mRNA 和蛋白质表达。HPLC-Q-TOF MS/MS、分子对接和分子动力学模拟确定 isoimperatorin 是 BSYZ 的主要活性成分，其对 ST8Sia II/IV 的结合亲和力分别为 -8.7 和 -7.6 kcal/mol（n = 3, RSD < 2%）。

结论
我们的研究表明，BSYZ 通过激活 ST8Sia II/IV-PSA-NCAM 通路促进海马神经发生以改善认知障碍。这些发现为 BSYZ 在 AD 治疗中的治疗潜力提供了机制证据。

引言
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，是全球痴呆症的主要原因。据估计，到 2050 年全球 AD 的患病率将达到约 1.39 亿例（Scheltens 等，2021）。目前公认的 AD 病理特征包括淀粉样 β（Aβ）肽的细胞外沉积，导致老年斑形成，以及过度磷酸化的 tau 在细胞内的积累，从而形成神经纤维缠结。这些病理变化最终导致突触功能障碍和神经元丢失（Frisoni 等，2025）。尽管 Aβ 积累和 tau 病理被广泛认为是 AD 的初始事件，但突触退化和神经元丢失，尤其是在海马区，与认知衰退更为直接相关（Fox 等，2025）。越来越多的证据表明，成年海马神经发生受到生理和病理因素的严格调控，包括衰老和神经退行性疾病（Babcock 等，2021；Salta 等，2023）。因此，增强海马神经发生已成为缓解 AD 认知功能障碍的有前途的治疗策略（Abbate，2023）。
多聚唾液酸化的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）在海马区高度表达，在神经发育、突触可塑性、神经元迁移和记忆形成中起着重要作用（Bhide 和 Colley，2025）。多聚唾液酸（PSA）是 α-2,8-连接的唾液酸残基的线性同聚物，在脊椎动物神经系统中主要通过 N-连接的糖基化附着在 NCAM 上（Bonfanti 等，2021）。这种翻译后修饰由两种多聚唾液酸转移酶 α-2,8-唾液酸转移酶 II 和 IV（ST8Sia II 和 ST8Sia IV）催化，它们独立或协同地在 NCAM 上合成不同长度的 PSA 链（Mori 等，2017）。庞大且高度水化的 PSA 链通过空间位阻减少细胞间粘附，从而促进神经元迁移、轴突生长、突触重塑和结构可塑性（Aonurm-Helm 等，2016）。此外，NCAM 的适当多聚唾液酸化增强了神经元对脑源性神经营养因子（BDNF）的响应性，从而支持神经元存活、突触可塑性和认知功能（Maguire 和 Breen，1995；Yamada 等，2020；Zhu 等，2024）。
临床观察和实验研究都表明，ST8Sia II/IV 表达减少和 PSA-NCAM 多聚唾液酸化受损是 AD 早期阶段的特征性病理特征，并在整个疾病进程中持续存在。唾液酸转移酶活性降低导致 NCAM 多聚唾液酸化不足，从而损害突触可塑性、海马神经发生和认知功能（Murray 等，2016，2018）。因此，恢复海马记忆相关区域的 PSA-NCAM 多聚唾液酸化被认为是一种有前途的 AD 治疗策略（Saini 等，2020）。然而，目前尚未报道能够有效靶向这一通路的药物。
根据中医理论，“肾精亏虚和髓海不足”是包括 AD 在内的痴呆症的基本发病机制（Lin 等，2022）。由于其多组分、多靶点和多通路的特点，中医作为一种补充治疗策略受到了越来越多的关注（Pei 等，2020）。Bushen-Yizhi 方剂（BSYZ）是一种经典的中药方剂，最初记录于清代《世醫彙录》，长期以来用于治疗肾虚综合征和改善认知功能。BSYZ 由蔓荆子（果实；She Chuang Zi）、人参（根茎；Ren Shen）、炒五味子（Zhi He Shou Wu）、牡丹皮（根皮；Mu Dan Pi）、光亮女贞子（果实；Nv Zhen Zi）和枸杞子（果实；Gou Qi Zi）按 3:3:2:2:2:2 的比例组成（Lai，2010）。根据传统的“君臣佐使”（中文称为 Jun-Chen-Zuo-Shi）配方原则（Wu 等，2014），BSYZ 方剂中的蔓荆子、枸杞子和光亮女贞子作为“君”药，负责补肾和滋养精气（Ma 等，2019）。人参和炒五味子作为“臣”药，传统上用于补充气和养血（Liu 等，2025）。牡丹皮作为“佐”药，自东汉《神农本草经》首次描述以来一直用于促进血液循环和缓解炎症（Wang 等，2017）。临床应用表明，BSYZ 通过减少氧化应激和 Aβ 沉积来改善 AD 患者的学习和记忆，并已被开发为医院批准的处方（Lai，2010；Qiu 等，2016；Pan 等，2017）。进一步的研究表明，BSYZ 减轻神经元凋亡、保持突触完整性并发挥显著的神经保护作用，进一步证实了这种六草药方剂的多个靶点和机制（Zhang 等，2017；Cai 等，2018；Hou 等，2018）。此外，我们之前的研究表明，优化后的 BSYZ 处方比单独使用各组成草药具有更好的生物利用度（Zhang 等，2014；Liu 等，2022）。然而，BSYZ 是否通过调节 PSA-NCAM 多聚唾液酸化来促进海马神经发生及其潜在的分子机制仍不清楚。
在本研究中，我们探讨了 BSYZ 通过调节 ST8Sia II/IV-PSA-NCAM 通路来促进海马神经发生和改善认知功能的药理效应和潜在机制。通过双侧注射伊博碱（IBO）建立了神经元损伤和认知障碍的小鼠模型。IBO 诱导兴奋性毒性神经元损伤、胆碱能功能障碍和海马功能缺陷，为研究受损神经元可塑性的机制和评估神经修复治疗策略提供了合适的模型（Morimoto 等，1998）。进行行为测试以评估认知表现，同时使用免疫荧光染色评估组织病理学变化。通过 Western blotting、定量逆转录 PCR（qRT-PCR）和蛋白质组学分析来确定 BSYZ 是否通过调节 ST8Sia II/IV 的表达来调节 PSA-NCAM 多聚唾液酸化。此外，开发了一种基于 DMB 衍生化的质谱方法来定量测量 PSA 相关的多聚唾液酸水平。使用 HPLC-Q-TOF MS/MS 识别负责调节 ST8Sia II/IV 的生物活性成分，随后进行分子对接和分子动力学模拟。最后，通过双免疫荧光标记评估海马神经发生。本研究提供了机制证据，证明 BSYZ 通过增强 PSA-NCAM 多聚唾液酸化来促进内源性神经发生，并支持基于中医的针对糖基化的 AD 治疗策略的发展。

部分摘录
BSYZ 提取物的制备
蔓荆子（L.）Cuss.（果实；She Chuang Zi）、人参（C. A. Mey.）（根茎；Ren Shen）、炒五味子（Zhi He Shou Wu）、牡丹皮（根皮；Mu Dan Pi）、光亮女贞子（W. T. Aiton）（果实；Nv Zhen Zi）和枸杞子（L.）（果实；Gou Qi Zi）从康美药业获得，并由广州中医药大学中药学院的魏莉教授鉴定。这些草药成分按比例混合。
BSYZ 改善了 IBO 小鼠的认知障碍
首先对 BSYZ 治疗后的 IBO 小鼠进行了行为测试，实验时间线如图 1A 所示。在向基底核注射伊博碱建立模型后，允许 3 天的恢复期。然后每天口服给予 BSYZ 四周，再进行行为评估。在牺牲前三天，腹腔注射 BrdU。为了评估干预效果，观察了运动活动和类似焦虑的行为。

讨论与结论
阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其特征是认知功能逐渐下降。在 AD 进行过程中，海马神经发生显著减少，重要的是，这种损伤可能先于典型病理特征的出现。几十年来，基于抗 Aβ 抗体的疗法被广泛用于 AD 的治疗。然而，即使有效清除了淀粉样斑块，认知和记忆功能仍然受损。

作者贡献声明
Guoqing Liu：正式分析、数据管理。
Qiwen Tan：方法学、正式分析、数据管理。
Jingjing Zheng：撰写——初稿、验证、方法学、正式分析、数据管理、概念化。
Yong Liang：撰写——审查与编辑、项目管理、资金获取、概念化。
Qi Wang：监督、资源管理、项目管理。
Ruiye Xie：方法学、数据管理。

未引用的参考文献
Bonfanti 和 Seki, 2021。

伦理声明
本研究遵循 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究得到了广州中医药大学的批准（批准号：20241014015）。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。

数据可用性
数据将根据请求提供。

资金声明
本工作得到了国家自然科学基金（编号：21904110）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2025A1515010474）和广东省普通高校重点研究平台与项目（编号：2025ZDZX2017）的财政支持。

利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。

Jingjing Zheng | Qiwen Tan | Guoqing Liu | Ruiye Xie | Qi Wang | Yong Liang
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