与肠道细菌的双物种互作驱动弯曲杆菌属的多重耐药性

《Journal of Infection》：Dual-Species Interactions with Intestinal Bacteria Drive Multi-Drug Resistance in Campylobacter

　　

摘要
目的：多重耐药（MDR）弯曲杆菌感染日益成为临床关注的问题，因为氟喹诺酮（FQ）耐药率不断上升，使大环内酯类药物成为主要治疗选择。研究人员调查了来自德国的临床弯曲杆菌样本中的多重耐药情况。
方法：研究人员分析了6,980株临床分离株（2010–2022年），进行了表型药敏试验，并对2,912个基因组进行了测序。对显示多重耐药性的培养物使用扫描电子显微镜（SEM）进行研究。
结果：研究人员发现453株（6%）弯曲杆菌样本对FQ和大环内酯类药物均耐药。其中两株空肠弯曲杆菌样本对来自十个不同类别的抗生素均耐药。基因组分析显示，这些样本尽管源于单菌落，却包含超过10%的肠球菌DNA读数。SEM确认存在与螺旋形弯曲杆菌交错的球菌状细菌。额外的基于培养的纯化产生了纯的空肠弯曲杆菌分离株，其保留了氟喹诺酮耐药性（FQR）但丧失了大环内酯类耐药性。混合样本中存在的多重耐药肠球菌属保护空肠弯曲杆菌免受高于最低抑菌浓度（MIC）的多种靶向核糖体抗菌药物的影响，而纯弯曲杆菌则对这些药物敏感。
结论：微生物互作对耐药表型的影响目前知之甚少。研究人员证明，与高耐药性肠道细菌的密切互作可诱导弯曲杆菌的多重耐药表型。这些发现强调，微生物环境塑造抗生素耐药性，并可能影响治疗结局。

**论文解读：与肠道细菌的双物种互作驱动弯曲杆菌属的多重耐药性**

**一、研究背景与科学问题**

弯曲杆菌病是一种主要的细菌性食源性疾病，在欧洲和美国年发病率分别为每10万人64.9例和19.5例。空肠弯曲杆菌（*Campylobacter jejuni*）和大肠弯曲杆菌（*Campylobacter coli*）是导致人类感染的主要菌种。健康个体感染通常呈自限性，局限于胃肠道，但少数情况下可发生血流感染等肠外表现，并可能并发反应性关节炎和格林-巴利综合征等神经系统疾病。

临床上，约三分之一的弯曲杆菌病病例需要抗生素治疗，治疗主要依赖大环内酯类或氟喹诺酮类药物。然而，超过60%的空肠弯曲杆菌和70%的大肠弯曲杆菌菌株已对氟喹诺酮耐药，使得大环内酯类成为仅存的一线治疗选择。近年来，携带可转移的23S rRNA甲基化酶基因*erm*(B)的弯曲杆菌菌株出现，该基因赋予对大环内酯类和林可酰胺类的耐药性，进一步加剧了多重耐药弯曲杆菌的流行关切。此外，在弯曲杆菌中已发现可能源自革兰氏阳性菌的耐药基因，如来自粪肠球菌的*optrA*，提示这些物种之间存在DNA转移。上述背景凸显了开展弯曲杆菌多重耐药机制研究的紧迫性，尤其是在临床样本中出现的广泛耐药表型迫切需要分子层面的解释。

**二、研究内容概述**

研究人员利用德国国家弯曲杆菌监测项目中2010至2022年间收集的大量临床胃肠道感染患者样本，共分析了6,980株空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌分离株。经过单菌落纯化、PCR物种鉴定和涵盖十个抗菌药物类别的表型药敏试验，发现453株（6%）样本同时对氟喹诺酮和大环内酯类耐药。尤其值得注意的是，其中两株空肠弯曲杆菌样本（MC14-02991.B和MC20-00984.21）对全部测试药物均表现耐药，包括罕见的碳青霉烯类耐药表型。对2,912个基因组进行测序后，发现这两株全耐药样本的测序读数中同时包含空肠弯曲杆菌和肠球菌的DNA，提示混合菌落的存在。扫描电子显微镜确认了球菌状肠球菌与螺旋形弯曲杆菌在同一菌落内的紧密空间关联。通过连续传代纯化获得的纯空肠弯曲杆菌分离株，其大环内酯类耐药性丧失，仅保留氟喹诺酮耐药性，而对应的纯肠球菌分离株则保持高耐药水平。这一发现明确表明混合培养中观察到的广谱耐药表型依赖于两物种间的共存状态，而非弯曲杆菌自身携带的稳定遗传耐药决定子。

**三、关键技术与方法**

本研究基于德国国家监测队列，分析了2010至2022年间收集的6,980株临床弯曲杆菌分离株，并对其中2,912个基因组进行测序。主要技术方法包括：(1) 表型药敏试验，采用肉汤微量稀释法测定多个抗菌药物类别的MIC值；(2) 全基因组测序和生物信息学分析，通过Kraken2和Mash进行物种分类和污染检测，使用ResFinder 4.1和AMRFinderPlus预测耐药基因；(3) 扫描电子显微镜用于观察混合菌落内细菌的超微结构特征；(4) 系列传代纯化技术，利用选择性培养基和不同培养条件分离混合样本中的单一菌种；(5) 肉汤微量稀释存活试验，用于定量评估混合培养中空肠弯曲杆菌在不同抗生素浓度下的存活阈值。

**四、研究结果**

**1. 两株临床多重耐药空肠弯曲杆菌分离株呈现出异常耐药谱**
通过对6,980株临床分离株的表型分析，453株对氟喹诺酮和大环内酯类同时耐药。其中菌株MC14-02991.B和MC20-00984.21对包括环丙沙星、阿奇霉素、克林霉素、美罗培南、四环素和庆大霉素在内的全部测试抗生素均显示耐药，包括在弯曲杆菌中罕见的碳青霉烯类耐药表型。

**2. 全基因组测序检测到污染的肠球菌DNA**
对2,912株表型特征明确的菌株进行基因组测序后，发现8株大环内酯类耐药弯曲杆菌携带*erm*(B)基因，其中包括两株全耐药样本。基因组的物种判定分析意外发现这两株样本含有肠球菌DNA读数，包含典型的革兰氏阳性菌耐药基因，如*tet*(M)、*lsa*(A)、*pbp5*等，提示肠球菌对观察到的耐药表型有直接贡献。

**3. 系列传代纯化改变弯曲杆菌的耐药表型**
通过选择性和微需氧培养条件，MC14-02991.B混合样本被成功分离为纯空肠弯曲杆菌（Cj14-02991.8）和纯粪肠球菌（Efs22-05285.1）。MC20-00984.21混合样本的纯化更具挑战性，共筛选27个菌落，其中21个被确认为纯空肠弯曲杆菌（Cj20-00984.4），均对阿奇霉素敏感；而6个混合物种菌落则保留阿奇霉素耐药性。这一耐药表型的转变提供了耐药性由肠球菌介导的实验证据。

**4. 扫描电子显微镜揭示混合样本中空肠弯曲杆菌与肠球菌的紧密关联**
SEM观察显示，球形肠球菌细胞紧密附着于螺旋形的空肠弯曲杆菌细胞，后者呈现由鞭毛构成的连接网络。纯化菌株则仅含单一形态的细菌。这一超微结构证据支持两物种在菌落内形成混合微菌落结构。

**5. 相关的肠球菌菌株导致了混合样本中大环内酯类和美罗培南MIC值的升高**
通过比较混合培养与纯化菌株的药敏结果，纯化的空肠弯曲杆菌仅对环丙沙星耐药，而混合培养则对所有测试药物耐药。数据证实混合培养中升高的阿奇霉素和美罗培南MIC值分别归因于粪肠球菌和屎肠球菌的存在。

**6. 全基因组序列分析揭示弯曲杆菌或肠球菌典型耐药基因的差异分布**
纯化菌株的WGS分析确认了耐药基因的物种特异分布：弯曲杆菌携带*oxa*-184和*gyrA* p.T86I突变，肠球菌携带*tet*(M)和*lsa*(A)。分析数据还显示菌株Cj20-00984.4和两株肠球菌共同携带*aaaE*-*sat4*-*aphA*-3（ASA）基因簇，该基因簇与氨基糖苷类和链丝菌素耐药相关。

**7. 多重耐药肠球菌的互作增强弯曲杆菌对多种抗生素类别的耐受性**
微稀释存活试验结果显示，与肠球菌共存时空肠弯曲杆菌在阿奇霉素、克林霉素、四环素和庆大霉素存在下的存活显著增强，但对美罗培南和诺尔斯菌素无保护效应。该保护效应也在模式菌株空肠弯曲杆菌ATCC 33560与屎肠球菌EFm22-05284.1的共培养体系中得到验证，提示这一互作介导的保护机制具有更广泛的适用性。

**8. 临床弯曲杆菌基因组中有0.7%含有污染物种的测序读数**
对1,801个弯曲杆菌WGS数据集的回顾性分析显示，2,912个测序样本中有19个（0.7%）含有超过10%的外源物种读数，主要为肠道来源的革兰氏阳性菌。其中12个为好氧物种（50%为肠杆菌属），7个为专性厌氧物种（如脆弱拟杆菌）。

**五、讨论与结论**

本研究的核心发现是，空肠弯曲杆菌和肠球菌可以在单菌落内形成紧密的双物种互作关系，这种互作赋予弯曲杆菌对多种抗菌药物（尤其是靶向核糖体的药物）的耐受能力。这一机制不同于经典的基因获得性耐药，而是一种可逆的、依赖种间互作的生理适应性改变。研究提示CmeABC外排泵系统可能参与了这一保护效应，因为受保护的抗生素（阿奇霉素、克林霉素、四环素）均为该系统的作用底物，但庆大霉素保护效应的存在表明外排泵并非唯一机制。多微生物微环境中的物理效应，如胞外聚合物影响抗生素渗透，也可能是保护作用的原因之一。研究还发现这些混合物种样本在临床菌株库中占0.7%，其中包括世界卫生组织列为ESKAPE病原体的屎肠球菌和阴沟肠杆菌复合群成员。

研究结论为：胃肠炎患者可以同时定植空肠弯曲杆菌和多重耐药肠球菌，二者形成紧密的种间互作关系，保护弯曲杆菌免受多种类别抗菌药物的杀伤，包括大环内酯类和林可酰胺类等临床重要药物。这种互作可能解释临床中出现的异常或广泛多重耐药模式，对临床治疗决策和耐药监测策略具有重要启示。