不同冠状病毒中的Nsp1具有保守的内切酶活性

《Journal of Molecular Biology》：Nsp1 from divergent coronaviruses has conserved endonuclease activity

　　摘要所有甲型冠状病毒和乙型冠状病毒均编码非结构蛋白1（Nsp1），这是一种重要的毒力因子，可抑制宿主基因表达。本研究中，我们利用来自不同甲型和乙型冠状病毒（SARS-CoV-2、MERS-CoV和HCoV-229E）的Nsp1，揭示了所有受测冠状病毒Nsp1蛋白均具有内在的内切核酸酶活性。此外，当Nsp1 N端结构域（NTD）中保守的精氨酸-赖氨酸基序被破坏时，该内切核酸酶功能被消除。对于SARS-CoV-2 Nsp1，真核起始因子3g（eIF3g）和40S核糖体作为辅助因子增强其内切核酸酶功能，但这些宿主因子在MERS-CoV和HCoV-229E Nsp1的内切核酸酶功能中并不保守。我们提出，SARS-CoV-2 Nsp1利用eIF3g和40S核糖体来增强其对RNA的亲和力并靶向宿主mRNA。当SARS-CoV-2、MERS-CoV和HCoV-229E的Nsp1通过顺式连接至RNA结合模块时，也观察到类似的内切核酸酶活性增强。总之，我们的结果表明，内切核酸酶活性是不同冠状病毒属Nsp1的固有特征，且该活性可能通过多样的宿主mRNA结合辅助因子集合靶向宿主mRNA。引言所有已知可感染人类的冠状病毒均属于甲型冠状病毒（α-CoV）或乙型冠状病毒（β-CoV）属。在五种人类β-CoV中，有三种已知可引起严重疾病，分别来自sarbecovirus和merbecovirus亚属——严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。然而，仅有两种α-CoV已知可感染人类——HCoV-229E（属于duvinacovirus亚属）和HCoV-NL63（属于setracovirus亚属），它们在健康成人中引起轻度的呼吸道疾病。当冠状病毒感染宿主细胞时，约30kb的单链、加帽且具有poly-A尾的病毒RNA基因组被宿主细胞机制翻译，产生非结构蛋白、结构蛋白和辅助蛋白。普遍而言，人类冠状病毒编码的第一个蛋白是非结构蛋白1（Nsp1），这是一种必需的致病因子。尽管不同冠状病毒Nsp1的主要氨基酸序列存在显著差异，但所有冠状病毒Nsp1均被预测具有β-桶状N端结构域（NTD），其上以α-螺旋为帽。此外，仅β-CoV的Nsp1具有C端结构域（CTD），由螺旋-转角-螺旋基序组成，通过柔性连接肽与NTD相连。β-CoV Nsp1的CTD已被证明对于结合40S核糖体亚基至关重要。Nsp1的主要作用是抑制细胞免疫反应，通过抑制宿主基因表达过程中的多个步骤来实现。人们推测β-CoV Nsp1采用三种不同的分子策略来改变感染细胞内的基因表达格局。第一，Nsp1通过其CTD占据40S核糖体亚基的mRNA入口通道，从而干扰翻译起始。该保守机制已通过多种人类和动物β-CoV的结构研究得到证实。第二，Nsp1与核糖体翻译起始机制协同作用，促进宿主mRNA的内切核酸酶切割；然而，该过程的精确机制细节仍然未知。甚至在SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV之间，降解的RNA靶标也存在差异，据报道MERS-CoV Nsp1优先降解核内转录本。最后，Nsp1通过与NXF1/NXT1复合物（核输出因子1/核转运因子2样输出因子1）相互作用，阻断宿主mRNA从核内输出，从而在胞质中将宿主mRNA从翻译机制中空间隔离。α-CoV Nsp1结合40S核糖体亚基的能力尚不清楚。与β-CoV不同，α-CoV Nsp1缺乏C端螺旋-转角-螺旋基序（图1A），因此推测α-CoV Nsp1不直接与40S核糖体亚基相互作用。与此预测相矛盾的是，先前的研究在共免疫沉淀（co-IP）实验中检测到HCoV-229E和HCoV-NL63 Nsp1与40S核糖体共同存在。然而，近期研究表明HCoV-229E Nsp1在蔗糖密度梯度离心过程中不与核糖体共同迁移。此外，对于HCoV-229E，来自转录组测序的细胞证据表明，它以类似但程度较低的方式耗竭宿主mRNA，与SARS-CoV-2和MERS-CoV Nsp1相比。相比之下，对于HCoV-NL63 Nsp1，近期报道显示它通过阻断新生转录来耗竭细胞mRNA。这是在细胞核内通过引发宿主RNA聚合酶II的泛素化和降解来实现的。这些报道表明，人类α-CoV的Nsp1可能通过多种机制抑制宿主翻译，仍需进一步研究才能全面确定α-CoV如何影响细胞mRNA池的格局。Nsp1降解宿主mRNA的机制基础仍缺乏深入理解，且大多数研究集中在SARS-CoV-2 Nsp1上。目前出现了两个关于SARS-CoV-2 Nsp1内切核酸酶功能的主流模型：在第一个模型中，Nsp1的内切核酸酶活性被认为依赖于40S核糖体和真核起始因子3g（eIF3g）。而在另一个模型中，Nsp1是独立的内切核酸酶，能够在无需其他因子存在的情况下切割核酸。我们着手建立关于Nsp1内切核酸酶功能及其对辅助因子依赖性的进一步机制认识。虽然SARS-CoV-2 Nsp1内切核酸酶活性对宿主辅助因子的需求存在争议，但突变分析一致表明SARS-CoV-2 NTD中的精氨酸/赖氨酸基序（R124/K125）对于内切核酸酶功能是不可或缺的。值得注意的是，同一保守碱性基序——NTD中的R124/K125，对于SARS-CoV-2 RNA转录本逃避翻译抑制也是必需的。MERS-CoV等进化距离较远的β-CoV以及α-CoV的Nsp1是否能切割宿主mRNA仍缺乏表征。对于MERS-CoV，Nsp1已被证实参与宿主mRNA周转，但这些研究主要依赖于间接的细胞读出结果，包括Nsp1转染后的北方印迹分析或全转录组RNA测序。重要的是，MERS-CoV感染中内切核酸酶元件的身份仍然未知。相反，现有证据仍与替代模型相符，即Nsp1通过间接方式促进mRNA周转，可能通过招募或调节宿主RNA降解机制，类似于先前对SARS-CoV-2 Nsp1提出的机制。除SARS-CoV-2外，人类冠状病毒中Nsp1介导的RNA周转的分子基础研究相对不足，亟需跨甲型和乙型冠状病毒属的进一步研究。在本研究中，我们结合生物化学实验和冷冻电镜技术，更深入地了解冠状病毒Nsp1对宿主mRNA的降解机制。我们证明所有受测α-CoV和β-CoV的Nsp1均可独立催化RNA的内切核酸酶切割。我们还展示了SARS-CoV-2 Nsp1最小体外重建内切核酸酶复合物（由SARS-CoV-2 Nsp1、eIF3g、mRNA和40S核糖体亚基组成）的低分辨率冷冻电镜重构，揭示了这些组分的空间排列。我们的结果证实，与单独的SARS-CoV-2 Nsp1相比，在40S核糖体亚基和eIF3g存在的情况下，SARS-CoV-2 Nsp1内切核酸酶活性的效率显著提高。eIF3g和40S核糖体通过赋予高亲和力和mRNA特异性，作为SARS-CoV-2 Nsp1内切核酸酶活性的宿主辅助因子发挥作用。eIF3g和40S核糖体亚基的功能贡献可以通过将eIF3g的RNA识别模块（RRM）或无关的RNA结合蛋白基序融合至SARS-CoV-2 Nsp1来重现。我们进一步表明，MERS-CoV和HCoV-229E Nsp1的功能类似于SARS-CoV-2 Nsp1，作为内切核酸酶发挥作用，但不使用eIF3g作为宿主辅助因子。同样，将MERS-CoV和HCoV-229E Nsp1融合至RNA结合蛋白基序也显著增强了它们的内切核酸酶活性。总之，我们的结果表明，α-CoV和β-CoV的Nsp1是不依赖于辅助因子的内切核酸酶，但对RNA缺乏高亲和力。我们提出，在生理条件下，冠状病毒Nsp1蛋白与宿主mRNA-蛋白（mRNP）复合物（如48S起始复合物）结合，以高效利用其内切核酸酶活性靶向宿主mRNA。部分节选Nsp1 NTD保守碱性基序对翻译抑制至关重要大量研究表明，Nsp1是宿主蛋白翻译的强效抑制剂，且内切核酸酶功能可能对这一过程有显著贡献。为了评估在SARS-CoV-2 Nsp1中鉴定的内切核酸酶RK基序在其他β-CoV和α-CoV中的保守水平，我们对SARS-CoV-2（β）、MERS-CoV（β）和HCoV-229E（α）的Nsp1进行了主序列比对。虽然SARS-CoV-2中Nsp1 NTD保守碱性基序的存在已被报道……SARS-CoV-2 Nsp1最小内切核酸酶复合物组分在MERS-CoV和HCoV-229E Nsp1中不保守随后我们试图确定先前为SARS-CoV-2 Nsp1鉴定的最小内切核酸酶复合物组分是否足以支持MERS-CoV和HCoV-229E Nsp1。我们按照先前描述的方法孵育了SARS-CoV-2最小内切核酸酶复合物的已知组分——纯化的40S核糖体、体外转录的蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入位点（CrPV IRES）mRNA和eIF3g。然后我们引入野生型Nsp1或缺失NTD保守碱性的Nsp1突变版本……讨论作为冠状病毒的必需致病因子，Nsp1通过防止细胞免疫并劫持宿主翻译因子用于病毒基因表达来发挥作用。多项研究表明，冠状病毒Nsp1导致宿主mRNA降解，且该活性在不同冠状病毒中均被观察到。然而，Nsp1这一内切核酸酶活性的机制基础仍存在很大争议，需要进一步研究。在此，我们证明了内切核酸酶……细菌表达与重组蛋白纯化本研究中使用的所有蛋白均利用大肠杆菌BL21（DE3）细胞进行重组表达，并在含有适当抗生素的Terrific Broth培养基中培养。除非另有说明，否则蛋白表达通过16°C、0.4 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导20小时来实现。全长Nsp1、eIF3gRRM或eIF3gRRM-Nsp1被克隆入pET28a蛋白表达载体，并带有N端6×His-MBP-Sumo标签。对于MBP-MS2-Nsp1，全长Nsp1（从……）利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢与资助本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）拨款F31AI181514和F30AI179078以及耶鲁大学自由支配资金资助（授予Y.X.）。Michael Vetick | Shravani Balaji | Shannon Henry | Swapnil C. Devarkar | Yong Xiong耶鲁大学分子生物物理与生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文，06511