利用同源衍生界面与AI预测界面表征CCR2同源二聚体

《Journal of Molecular Biology》：Characterizing CCR2 homodimers using homology-derived and AI-predicted interfaces

　　

摘要

解析G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）寡聚体的功能角色，需要明确其结构组织方式，然而由于其7次跨膜（transmembrane，TM）结构域固有的构象柔性，这一目标仍面临挑战。本研究聚焦于趋化因子受体CCR2同源二聚体界面的确定。CCR2是炎症反应的关键组分，目前尚无获批的拮抗剂。研究人员结合同源建模（一种经典的计算模拟方法）或基于人工智能的AlphaFold-Multimer预测，并辅以分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟，构建了CCR2同源二聚体模型。通过在每个预测界面引入半胱氨酸并进行细胞内的化学交联实验，研究人员评估了所预测模型的生物学相关性。该细胞内实验支持同源建模的预测结果，但不支持AlphaFold-Multimer的预测结果，并证明CCR2通过至少两种不同的界面形成同源二聚体，分别涉及跨膜结构域TM5（I5）或TM5与TM6（I56）。该CCR2同源二聚体的结构排布为进一步研究二聚化功能后果及理性设计CCR2选择性药物提供了有价值的模型。

**论文解读：CCR2同源二聚体界面的计算建模与实验验证**

**一、研究背景与科学问题**

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）是最大的膜蛋白家族之一，具有7次跨膜（transmembrane，TM）结构域，是药物治疗的重要靶点。越来越多的证据表明，GPCRs能够形成同源或异源二聚体及寡聚体，这一过程可影响受体的细胞内运输、配体结合、G蛋白激活及信号选择性等多种功能特性。CC趋化因子受体2（CC chemokine receptor 2，CCR2）是炎症反应中的关键受体，介导单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞及髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）等免疫细胞向靶组织的募集。CCR2参与动脉粥样硬化、关节炎、慢性肝炎、代谢综合征及癌症等多种炎症相关疾病的病理过程。尽管过去十余年中已开发出多种CCR2拮抗剂，但多数缺乏特异性或有效性，并伴有不良副作用，尚无一种成功通过临床试验。因此，深入理解CCR2的结构组织特征，对于开发具有构象选择性的药物具有重要意义。

已有生化和生物物理研究（如能量转移方法）提示CCR2存在同源二聚化，并可与CC趋化因子受体5（CCR5）或CXC趋化因子受体4（CXCR4）形成异源二聚体。CCR2同源二聚化可能对其受体信号转导及CCR2介导的细胞迁移至关重要。然而，关于CCR2二聚化所涉及的具体界面研究甚少，这限制了对通过不同CCR2同源二聚体界面形成的四级结构功能意义的深入探索。在蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）中现有的四个CCR2结构中，除一个通过X射线晶体学获得的不对称二聚体结构外，其余均为单体形式。该晶体学二聚体结构中，用于稳定受体以便结晶的rubredoxin融合蛋白对两个原聚体间的相互作用有显著贡献，因此该二聚体是否存在于天然受体中尚存疑问。基于此，研究人员采用两种计算策略——基于同源建模的传统方法和基于人工智能（artificial intelligence，AI）的AlphaFold-Multimer预测——来构建CCR2同源二聚体模型，并通过细胞内的半胱氨酸交联实验对预测界面进行生物学验证。

**二、主要关键技术方法**

研究人员采用了多种核心技术方法：基于同源建模的二聚体模型构建（以已获实验验证的CCR5同源二聚体界面和CCR2晶体学二聚体为模板）；基于AlphaFold-Multimer和Boltz-2的AI结构预测；全原子分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟评估模型稳定性与界面埋藏表面积（buried surface area，BSA）；基于半胱氨酸定点突变的化学交联实验（在预测界面残基处引入半胱氨酸突变，利用CuPhenanthroline（CuP）氧化剂促进二硫键形成）；流式细胞术检测突变体细胞表面表达水平；Western blotting检测二聚体形成；LC-MS/MS质谱分析确认免疫反应条带为CCR2蛋白。实验验证采用人胚肾HEK 293细胞系，使用CCR2b异构体（因CCR2b在细胞表面表达良好，便于验证突变体的正确折叠）。

**三、研究结果**

**AlphaFold预测出同源建模之外的额外界面。** 同源建模基于已获验证的CCR5同源二聚体界面和CCR2晶体学二聚体，构建了三种CCR2同源二聚体模型：I5（对称性TM5-TM5界面）、I56（TM5-TM6界面）和I4-56（非对称TM4-TM5/TM6界面）。AlphaFold-Multimer生成了25个CCR2同源二聚体模型，观察到三种界面：I34a（主要涉及TM4的对称性结合）、I45a（TM4-TM5界面）和I56a（TM5-TM6界面）。其中I56a模型显示显著的空间位阻冲突和最低的界面模板建模得分（ipTM），表明模型质量较差。经MD模拟评估后，I5、I56、I34a和I45a表现出良好的界面兼容性，BSA在200 ns模拟后增加15%至37%；而I4-56的BSA持续下降，被认为不具有生物学相关性。最终筛选出四个结构上合理的模型：同源建模产生的I5和I56，以及AlphaFold产生的I34a和I45a。

**设计用于交联实验的受体突变体。** 研究人员利用MD模拟确定了各预测界面中两个原聚体上距离相近且面对面的残基对，选择具有脂肪族侧链的氨基酸位点（以最小化对受体整体组织和稳定性的扰动），并优先选择TM区域内的位点以避免不必要的翻译后修饰。对于I5界面，选择了TM5中部的I204^5x41和L213^5x49；对于I56界面，选择了TM6细胞外端的F268^6x60和F271^6x63；对于I34a和I45a界面，分别选择了TM4中的V158^4x43/V169^4x54和V167^4x52/F170^4x55残基对。此外，选取TM4的V159^4x44和TM5的L216^5x52作为阴性对照，这两个残基在所有涉及相应TM的二聚体模型中，两个原聚体的侧链均指向相反方向。

**半胱氨酸交联实验仅验证了同源建模预测的CCR2模型。** 研究人员在CCR2b-WT中将上述预测界面残基逐一替换为半胱氨酸，通过流式细胞术验证了各突变体的细胞表面表达水平，并在有无CuP处理条件下通过Western blotting检测二硫键捕获的二聚体。CCR2b-WT主要以单体形式存在，检测到40 kDa和50 kDa两种单体条带（可能对应不同N-糖基化形式），二聚体（80 kDa）约占CCR2b总形式的7%，CuP处理后约为10%。TM4突变体（与I34a相关的V158C和V169C，与I45a相关的V167C和F170C）以及TM4和TM5的阴性对照突变体（V159C和L216C）表现出与CCR2b-WT相似的模式。相比之下，TM5突变体（与I5相关的I204C和L213C）和TM6突变体（与I56相关的F268C和F271C）在无CuP条件下使二聚体或高阶寡聚体形成增加至约17%，CuP处理后增加至约20%。这些数据突出表明TM5和TM6在CCR2b二聚化中的关键作用，验证了同源建模预测的I5和I56模型，支持CCR2二聚体的存在。然而，在AlphaFold预测的模型中，未检测到与WT相比更优的二聚化模式。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，尽管许多A类GPCR同源和异源二聚体已被描述，但靶向二聚体的药物（如双价配体）开发仍处于新兴阶段，其挑战在于预测和验证具有生物学相关性的二聚体界面。分子建模和交联验证表明，CCR2在无配体状态下通过TM5形成对称二聚体，TM5可与自身或TM6结合，提示I5和I56两种结合模式可能共存。这些界面基于非活性受体的晶体结构，未来研究需探索这两种界面与活性-活性或活性-非活性受体二聚体的兼容性，以及不同二聚体界面与G蛋白偶联的对应关系。其他计算研究曾预测CCR2存在涉及TM1的界面，该区域也被实验证明可介导CCR5和CCR2的同源二聚化，并参与CCR2信号转导，提示细胞表面存在多种构象的动态转换。

关于AlphaFold-Multimer，尽管其预测的多个二聚体界面涉及共享的结构元件（特别是TM5），但所有AlphaFold生成的模型均与同源建模模型不同。I45a模型曾被另一研究组报道，但尚未经实验验证。近期一项基于粗粒化meta动力学模拟的CCR5二聚化研究鉴定出最稳定的对称CCR5同源二聚体界面，与本研究生成的AlphaFold I45a模型高度相似（涉及等效氨基酸），但该模型同样缺乏体外数据验证。这表明，尽管AI预测工具具有变革性影响，但其对GPCRs仍存在局限性——GPCRs是高度动态的膜蛋白，其构象状态取决于配体结合、信号伙伴、脂质环境和寡聚化状态。研究人员的基准测试表明，AlphaFold2在单独建模受体时倾向于非活性GPCR构象，而恢复活性态模型需要模板偏置或包含G蛋白。

研究人员进一步评估了AlphaFold v3和Boltz-2等更新工具。AlphaFold v3排名第一的模型ipTM得分极低（0.13），结构排布与所有先前描述的解决方案均不同。Boltz-2生成的25个模型中原聚体结构质量良好，五个排名靠前的模型ipTM>0.50，均呈现出涉及TM1、TM6和TM7的对称界面；在ipTM为0.30-0.50的模型中，发现了与实验验证的基于同源建模的I56模型高度相似的簇，以及一个类似AlphaFold-Multimer I45a模型的单体。这些后续结果突显了不同AI预测工具之间的性能差异，且Boltz-2给出了与两个已验证同源模型之一一致的解决方案。

研究结论指出，该建模工作为CCR2二聚体排布提供了新见解，为研究CCR2同源二聚化功能后果及药物设计提供了有价值的起点。此外，AlphaFold-Multimer在GPCR二聚体预测中的开创性应用结果表明，基于相似蛋白结构同源建模的预测比目前可用的AI方法更为可靠，生物学验证仍然是确认计算结构预测的必要步骤。