通过基于结构的虚拟筛选和生物学验证发现新型AAK1抑制剂

《Journal of Molecular Structure》：Discovery of novel AAK1 inhibitors through structure-based virtual screening and biological validation

　　

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  基于结构的虚拟筛选结合计算模拟鉴定出具有未报道骨架的AAK1抑制剂。
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  三种候选化合物表现出纳摩尔级别的AAK1抑制活性；化合物1429881-91-3活性最强，与阳性对照LP-935509相当。
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  这些候选化合物表现出稳定的靶标结合和理想的预测ADMET特征，为AAK1相关药物发现提供了有价值的先导化合物。

引言

连接蛋白激酶1（AAK1）是Ark1/Prk1家族中一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶[1]。AAK1是负责磷酸化衔接蛋白复合物2（AP-2）μ2亚基苏氨酸156（T156）的特异性且必需的激酶[2]。通过这一磷酸化过程，AAK1介导包被囊泡的形成和转运，进而影响细胞内吞和跨膜信号转导[3]。近年来，AAK1的病理功能成为研究焦点。首先，AAK1在中枢神经系统（CNS）中广泛表达。通过调控AP-2的μ2亚基的磷酸化状态，AAK1控制神经元中的包被蛋白介导的内吞作用，从而影响神经递质释放和受体表达水平。此外，AAK1通过调控包括α2-肾上腺素能受体信号通路在内的细胞内信号通路，发挥神经保护作用（如抑制神经元凋亡和退化）。这些功能提示AAK1可能参与神经病理性疼痛和神经退行性疾病[4,5]。其次，AAK1已被确认为多种病毒利用的宿主关键靶标，用于通过包被蛋白依赖的内吞途径进入宿主细胞[6,7]。

目前，已有数种AAK1抑制剂进入临床和临床前开发阶段。BMS-986176（又称LX-9211，图1）是一种高度选择性AAK1抑制剂，具有良好的口服生物利用度，已在针对糖尿病周围神经病理性疼痛（NCT04455633）和带状疱疹后神经痛（NCT04662281）的II期临床试验中进行评估[8]。LP-935509（图1）是一种具有治疗神经病理性疼痛和病毒感染双重潜力的AAK1抑制剂。临床前研究已证明其在神经病理性疼痛模型中的镇痛效果，以及通过阻断病毒进入所需的内吞途径抑制SARS-CoV-2复制的能力[9]。该化合物目前正在I期临床试验中进行评估。LP-922761（图1）具有外周组织限制性分布特征，适用于周围神经病理性疼痛、炎性疼痛和抗病毒治疗等适应症，这些疾病不需要穿透血脑屏障[9]。截至目前，LP-922761仍处于临床前研究阶段。这些发现表明，AAK1抑制剂具有治疗神经系统疾病和抗病毒的双重治疗潜力。

在目前的临床实践中，慢性疼痛治疗仍主要依赖阿片类药物和非甾体抗炎药（NSAIDs），缺乏其他替代方案。然而，长期使用与成瘾风险或胃肠道毒性相关[10]。BMS-986176的临床前研究已证明其能够穿透中枢神经系统，并在神经病理性疼痛模型中减少疼痛相关行为，而不影响阿片类途径[8]。然而，大多数已报道的AAK1抑制剂骨架多样性有限。此外，一些已获批的激酶抑制剂也被重新利用，包括巴瑞替尼（图1）[11]、舒尼替尼（图1）[12]和芦可替尼（图1）[7]。尽管这些药物主要用于癌症和自身免疫疾病，但其AAK1抑制活性可能代表其重新利用的潜在机制。因此，开发具有结构新颖性、良好药物性质和安全性的AAK1抑制剂具有重要意义。

传统寻找激酶抑制剂的方法大多依赖于对已知活性骨架的修饰以及构效关系研究[[13]、[14]、[15]、[16]、[17]]。与这些传统方法相比，基于结构的药物设计（SBDD）利用靶标蛋白的三维结构，通过结合分子对接和虚拟筛选，可以更高效地鉴定潜在的小分子抑制剂。该方法已在药物发现的早期阶段得到广泛应用[18,19]。在这类研究中，研究者通常利用靶标蛋白的三维结构进行虚拟筛选，并对来自现有数据库或新组装库的化合物进行对接计算[[20]、[21]、[22]、[23]、[24]]。一般工作流程包括检查结合口袋特征、观察蛋白-配体相互作用、通过计算结合亲和力对化合物进行评分排序，最后选择得分较高的化合物进行实验验证[25]。

从已解析的AAK1晶体结构出发，针对化合物数据库进行了基于结构的虚拟筛选，以发现可能结合于结合口袋的命中化合物。初步筛选后，利用分子对接和结合自由能分析对候选分子进行分析，以评估其对接构象、关键相互作用残基和相对结合强度。根据对接和能量结果，将若干具有新颖骨架和预测活性的化合物视为潜在AAK1抑制剂。为进一步评估复合物结合稳定性，我们对代表性的AAK1-配体复合物进行了分子动力学模拟。这些模拟表明蛋白质的构象随时间波动，且配体在结合口袋中保持稳定结合。随后，通过激酶活性测定鉴定出化合物1429881-91-3、181223-80-3和2321337-71-5具有纳摩尔级别活性，其中化合物1429881-91-3活性最强（IC₅₀ = 4.184 nM），在相同实验条件下与阳性对照LP-935509（IC₅₀ = 5.03 nM）相当。总之，本研究鉴定出若干靶向AAK1的新型小分子抑制剂，为后续AAK1靶向药物的优化和理性设计提供了有前景的命中候选化合物。

章节摘要

蛋白和配体准备

AAK1晶体结构（PDB ID: 5TE0）从RCSB蛋白质数据库获取。蛋白质准备在Maestro 11.9中使用Protein Preparation Wizard模块进行[26]，包括添加氢原子、删除水分子和离子以及分配质子化状态。随后使用OPLS3e力场通过能量最小化对结构进行优化。

本次基于对接的虚拟筛选共使用555,379个化合物，主要来源于

结合位点分析

此处使用了AAK1与多靶标抑制剂BIBF 1120（尼达尼布）结合的高分辨率晶体结构（PDB ID: 5TE0）。该结构分辨率高，无关键残基缺失，且活性位点定义良好。AAK1的结合口袋主要由残基Ala53、Leu52、Val60、Cys193、Val104、Phe195、Met126、Met94、Leu183、Ala72、Cys129和Asp127组成。

BIBF 1120在AAK1结合口袋中的相互作用模式如图2所示。一个氢键

结论

在本研究中，我们整合对接和结合自由能计算的计算筛选方案，从中筛选出74个具有合理结合模式和对接分值的AAK1小分子化合物。然后选取六个代表性化合物进行进一步的结构和功能验证。分子相互作用分析显示，所有命中化合物均与AAK1活性位点中的关键残基形成相互作用，包括Ala72、Leu183、Met126、Cys193、Val104、

数据可用性

数据应要求提供。

CRediT作者贡献声明

汤若冰：撰写——初稿、可视化、验证、软件、资源、形式化分析、数据整理。孙宇：可视化、验证、形式化分析、数据整理。胡晓燕：可视化、软件、形式化分析、数据整理。邵泰利：验证、形式化分析、数据整理。马立云：软件、形式化分析、数据整理。李仁杰：形式化分析、数据整理。唐琳：验证、调查、形式化分析、数据整理。周凌云：

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文工作的财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到安徽省高等学校自然科学研究项目（2024AH051888）、安徽省高校STEM学科教师企业挂职与实训项目（2025jsqygz39）、博士科学研基金（WYRCQD2023022）、2025年省级新时代教育优质工程项目（2025zyxwjxalk369）以及安徽省大学生创新创业训练项目的资助。

汤若冰|孙宇|胡晓燕|邵泰利|马立云|李仁杰|唐琳|周凌云|侯少华