吡嗪-2-羰基肼衍生的氮杂环丁酮杂合体的合成、表征、计算机模拟研究及生物活性评价——作为潜在抗结核药物

《Journal of Molecular Structure》：Synthesis, Characterization, In Silico Studies, and Biological Evaluation of Pyrazine-2-carbohydrazide-Derived Azetidinone Hybrids as Potential Antitubercular Agents

　　

•合成了十五种新型吡嗪-2-羧酰肼-氮杂环丁酮杂合体（T1-T15）。•先导化合物表现出强烈的DprE1结合能力（-8.7至-11.8 kcal/mol）。•T11-DprE1复合物在100 ns MD模拟期间保持稳定。•T11表现出强效抗结核活性，并具有高度选择性。

**引言**

结核病（TB）由结核分枝杆菌（Mtb）引起，至今仍是当今最具破坏性的传染病之一，造成了一个跨越社会和经济界限的灾难性全球健康问题。根据WHO《2025年全球结核病报告》，2024年约有1080万例新发结核病感染，报告约125万例死亡，这一数字凸显了现有药物方案的严重不足[1]。该疾病的恶化与耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的发病率不断增加有关，2024年估计有40万例新发MDR-TB病例和超过28,000例新发XDR-TB病例[1,2]。该疾病的全球负担高度集中在东南亚、撒哈拉以南非洲和西太平洋地区，在这些地区，贫困、营养不良、HIV共感染和薄弱的医疗服务系统进一步促进了疾病的传播和治疗的有效性降低[3]。现有的化学治疗手段存在诸多局限。由异烟肼（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇组成的标准治疗方案持续至少六个月，对药物敏感型结核病效果良好；然而，漫长的疗程导致依从性差和耐药性[4,5]。MDR-TB的治疗涉及使用二线药物持续18至24个月，其特点是对比药物敏感方案具有更大的毒性、更高的成本以及低得多的治愈率[1]。全球范围内已对抗结核药物发现管线进行了大量投资；然而，目前仍不足以应对耐药问题，需要开发全新的结构实体，以与当前所有抗结核药物不同的方式靶向结核病。

结核药物发现中最有前景的靶点之一是去十萜基磷酸-β-D-核糖2'-氧化酶（DprE1）。DprE1是一种FAD依赖性氧化还原酶，由Mtb的基因Rv3790编码。该酶催化将去十萜基磷酸-D-核糖（DPR）转变为去十萜基磷酸-D-阿拉伯糖（DPA）的两步差向异构化的第一步，DPA是阿拉伯聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖合成中至关重要且独特的前体[6,7]。阿拉伯聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的必要构建模块；因此，它们的破坏导致细胞壁完整性丧失和杀菌活性。重要的是，DprE1专属于分枝杆菌，因为在哺乳动物中不存在其同源物，这提供了内在特异性和低毒性[8,9]。DprE1酶的活性位点包括Cys387、His132、Tyr314、Lys418和Gln336等具有催化重要性的残基，这些残基通过X射线晶体学分析被一致确定为共价和非共价抑制剂的重要结合点[10,11]

DprE1作为有前景的抗结核药物靶点的重要性首先由Makarov等人于2009年确立，他们证明硝基苯并噻二唑酮BTZ-043通过酶促硝基还原不可逆地抑制DprE1，导致与催化残基Cys387形成共价半缩醛加成物[12]。这一里程碑式的发现激发了广泛的药物化学研究，产生了多种结构多样的DprE1抑制剂和抗结核药物（图1），包括共价抑制剂BTZ-043 [13]、DNB1 [14]、PBTZ-169 [15]和VI-9376 [16]，以及非共价抑制剂TCA1 [17]、TBA-7371 [18]、OPC-167832 [19]和最近报道的LK-60 [20]。在这些抑制剂中，OPC-167832已成为最有效的DprE1抑制剂之一，对结核分枝杆菌H37Rv表现出 remarkable 活性，报告的MIC值为0.0006 μM，同时保持了针对耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的优异疗效。除这些高级别候选物外，还报道了多种化学多样的骨架，包括苯并咪唑、噻二唑、吲唑磺酰胺、嘌呤和嘧啶等，它们通过非共价相互作用抑制DprE1，凸显了该酶的结构多样性和成药性[[21], [22], [23], [24]]。此外，最近基于结构的虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟方面的进展显著加速了新型DprE1抑制剂的识别和优化，为下一代抗结核药物的理性设计提供了有价值的见解[25]。

β-内酰胺（氮杂环丁-2-酮）环结构是一种张力单环四元酰胺，是药物化学领域中被广泛研究的药效团之一。除了作为青霉素和头孢菌素类抗生素的共同环结构所具有的重要性外，单环2-氮杂环丁酮药效团因其已确立的抗结核、抗菌、抗真菌和抗炎活性而持续受到极大关注[26]。合成方法可以通过Staudinger [2+2] 烯酮-亚胺环加成反应轻松获得，该反应于1907年被提出，其中由酰氯脱卤化氢原位生成的烯酮对亚胺（席夫碱）进行区域选择性环加成，从而得到3-氯-氮杂环丁-2-酮环[27]。该反应仍然是单环β-内酰胺构建的主要支柱之一，关于其目的为药效团分子杂化化而存在的范围和局限性最近已进行了综述[28,29]。包括喹啉、恶二唑、噻二唑和唑环体系在内的氮杂环丁酮-杂环化合物被发现具有比单一杂环更好的抗菌活性，从而证明了分子杂化化的有效性[30]。

吡嗪是一种对称的二氮杂环化合物，其氮原子位于1-位和4-位，在抗结核药物开发中代表着一种独特的结构。其最著名的类似物吡嗪酰胺；一种前药，其活性代谢物吡嗪酸干扰细菌膜的能量代谢和辅酶A生物合成，是一种有效的药物，被列入结核病的一线治疗，是唯一一种对半休眠细菌起作用的药物。吡嗪环的电子缺乏性导致细胞膜通透性增加，这是由于分枝杆菌细胞壁的脂溶性性质，而氮原子的孤对电子则充当氢键受体[31,32]。最近报道的研究证实了含吡嗪杂化化合物的有效性；Shivakumar等人制备了含吡嗪的衍生物，对Mtb H37Rv的MIC为1.56 μg/mL；吡嗪-恶二唑-三氮唑-噻二嗪杂化体展示了其抗分枝杆菌活性；吡嗪-酰肼基-苯磺酸盐杂化体通过基于结构的药物设计被发现为非共价DprE1抑制剂[[33], [34], [35], [36], [37], [38]]。

尽管吡嗪和氮杂环丁酮骨架各自展示了有前景的抗结核活性，但将吡嗪-2-羧酰肼与β-内酰胺药效团进行系统整合用于靶向DprE1的药物发现仍主要未被探索。因此，本分子设计基于合理的杂化策略，旨在将这些结构基元的互补药理学性质结合到单一分子框架中。选择吡嗪核是因为其在临床使用的抗结核药物如吡嗪酰胺中的既定作用，以及其在DprE1结合口袋内参与有利氢键作用和π-相互作用的能力。引入羧酰肼连接基是为了提供构象柔性，同时引入额外的氢键供体和受体位点，以增强蛋白-配体相互作用。选择氮杂环丁-2-酮环是因为其已充分记录的抗菌活性、结构刚性和通过其张力β-内酰胺骨架改善分子识别的能力。此外，系统改变芳香取代基预计可以调节所得杂化体的电子特性、空间环境、亲脂性和疏水相互作用，从而实现全面的构效关系研究。总之，这种分子杂化化方法预计可以生成多功分子，具有增强的DprE1亲和力、改善的抗分枝杆菌药效和优良的类药性质[33,38,39]。在抗感染领域，一个被尝试的有前景的方法是吡嗪和β-内酰胺药效团的合并。例如，Das和Mehta的研究表明，具有吡嗪、1,3,4-恶二唑和氮杂环丁酮药效团单元的杂化分子显示出优异的抗结核和抗菌特性，证实了此类结构的可行性[40]。即便如此，尚没有研究试图全面评估由吡嗪-2-羧酰肼衍生的Staudinger β-内酰胺与不同芳基、杂芳基和多环芳香取代基作为DprE1酶抑制剂的结构-活性关系谱。

表1

鉴于以上讨论，本研究旨在解决以下研究空白：(i) 缺乏针对DprE1设计新型吡嗪-2-羧酰肼衍生的β-内酰胺杂合体；(ii) 缺乏对此类化合物的全面波谱和量子化学表征；以及(iii) 缺乏对吡嗪-氮杂环丁酮缀合物在抗结核活性、抗菌活性、抗真菌活性和细胞毒性方面的多维生物学和计算表征。我们在此呈现了十五种新型吡嗪基3-氯氮杂环丁-2-酮类似物（T1-T15）的设计、多步合成和全面波谱表征（1H-NMR、13C-NMR、HR-ESI-MS）。这些化合物已进行以下筛选：(i) 计算机模拟ADMET性质；(ii) 对DprE1（PDB: 4P8N）的结合亲和力和抑制常数；(iii) 先导复合物100 ns MD模拟和MM-GBSA自由能计算；(iv) 通过B3LYP/6-31G**理论水平计算的全局反应性描述符、HOMO-LUMO图、MEP图和电子密度分布；(v) 针对Mtb H37Rv的体外抗结核活性；(vi) 针对四种临床病原体的抗菌活性；(vii) 针对黑曲霉的抗真菌活性；以及(viii) 通过MTT法对Vero细胞的细胞毒活性。本研究标志着关于吡嗪-2-羧酰肼基β-内酰胺杂合体作为DprE1抑制剂的设计、合成和评估的首次系统性多维研究，旨在开发抗结核和广谱抗菌药物，并为未来的先导化合物优化形成坚实的构效和构-性质框架。

**章节片段**

**材料与方法**

本研究中使用的所有化学药品和试剂均为分析纯，购自商业公司，即Sigma-Aldrich、TCI Chemicals和Alfa Aesar，未经进一步纯化。反应监测通过薄层色谱法（TLC）进行，使用硅胶铝板（Merck 60 F254）和乙酸乙酯/石油醚溶剂体系。斑点使用紫外光进行显色。合成化合物的熔点通过[测量]。

**化学部分**

考虑到计算机模拟研究中观察到的积极结果，已成功按照方案1中描述的合成途径合成了吡嗪基氮杂环丁-2-酮衍生物（T1-T15）。合成旨在将两个重要的药效团，即吡嗪基团和β-内酰胺基团，连接到一个结构中。吡嗪基团代表一种多功能杂环体系，具有广泛的生物活性，[和β-内酰胺]。

**结论**

在本研究中，成功设计、合成了十五种新型吡嗪-2-羧酰肼衍生的氮杂环丁酮杂合体（T1-T15），并通过1H NMR、13C NMR和HR-MS分析进行了全面表征。通过对合成化合物进行分子对接、分子动力学模拟、DFT计算、ADME预测和体外生物测定，研究了其作为靶向DprE1抗结核药物的潜力。分子对接表明化合物与[受体]具有有利的结合。

**CRediT作者贡献声明**

Shivakumar：撰写-原稿、可视化、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念化。Asha Danthi：可视化、验证、数据整理。Shrutesh Wagh：方法学、形式分析。Abhishek Prakash Sharma：撰写-原稿、可视化、数据整理。Amgoth Ramesh：方法学。Udayakumar D：撰写-审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取、数据。

**利益冲突声明**

作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

**致谢**

我们衷心感谢印度苏拉塔卡尔国家信息技术学院（NITK）中央研究设施（CRF）为本研究提供的所有必要的基础设施和资源支持。

Shivakumar | Asha Danthi | Shrutesh Wagh | Abhishek Prakash Sharma | Amgoth Ramesh | Udayakumar D | Srikanth Jupudi | Chagaleti Bharath Kumar | Revanasiddappa BC | Pavithra Pradeep Prabhu | Srinivas Mutalik