微秒尺度分子动力学模拟观察到的C5aR2通过β-arrestin依赖性通路的信号转导机制

《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》：C5aR2 signaling mechanisms via the β-arrestin-dependent pathway observed in microsecond-scale MD simulations

　　

# 摘要

补体系统主要调节固有免疫，参与非特异性抗病原体防御，并与适应性免疫相关联。其组分之一C5转化酶启动补体级联反应的最后阶段，导致C5被切割为C5a和C5b，并形成膜攻击复合物，从而引起细胞溶解。此外，C5a作为促炎介质，通过调节白细胞趋化作用发挥作用。C5a与两种G蛋白偶联受体（GPCRs）结合：C5aR1和C5aR2。C5aR1的激活通过G蛋白和β-arrestin介导的信号传导参与炎症反应，而C5a结合C5aR2仅引发β-arrestin信号通路的效果尚不明确。C5aR2常被视为诱饵受体，在各种疾病模型中表现出促炎和抗炎双重作用。为阐明C5aR2信号传导的生理意义和治疗潜力，我们以活化态β-arrestin构象为起点，对C5a–C5aR2–β-arrestin 1复合物进行了4 μs尺度的分子动力学模拟。以C5aR1的PDB结构中观察到的两种可能的螺旋8（H8）构象作为C5aR2的模板进行测试。经典的、向外指的H8，缺乏两亲性氨基酸组成，在所有模拟中均发生解旋。非经典的、倒置构象的H8在长达4 μs的模拟中保持稳定，同时伴随轻微的、不完全的顺时针旋转以及TM7的同步外移，类似于甜味GPCR受体中的情况。然而，在两种模拟系统中，H8的短疏水片段（LPAA）在整个4 μs模拟过程中始终形成与脂双层的稳定锚定。基于我们的观察，我们提出H8可能仅限于这一短螺旋疏水LPAA锚定片段，用于稳定活化态β-arrestin构象。这些发现可能解释C5aR2与C5aR1相比其独特的、非G蛋白介导的信号传导方式，并为两种C5a介导的信号通路提供见解，这两种通路在炎症性疾病治疗中显示出显著不同的治疗潜力。

## 引言

固有免疫和适应性免疫系统共同抵御病原体，维持对环境压力的免疫反应平衡。这两个系统的品质与强度保障了基因组适应性，从而实现物种生存。补体系统的多级联信号传导主要调节固有免疫应答。抗原-补体系统通过经典信号通路激活，将适应性免疫与固有免疫相结合。同时，补体蛋白对病原体的调理作用作为标记，促进长期适应性免疫记忆的建立[1]。补体系统激活可通过四条途径发生：经典途径、凝集素途径、替代途径[2]和外源性蛋白酶途径[3]。虽然每条途径的启动方式不同——经典途径由补体成分C1q与抗原-抗体复合物结合启动；凝集素途径由甘露糖结合凝集素与微生物表面的甘露糖及其他糖类结合启动；替代途径由直接结合病原体表面启动——但前三种途径最终汇聚于C3转化酶的产生[2]。该酶切割补体成分C3，生成C3a和C3b。C3b随后形成C5转化酶（经典和凝集素途径中为C4b2b3b，替代途径中为C3bBbC3b），后者将补体成分C5切割为C5a和C5b[1]。在外源性蛋白酶途径中，C5由凝血酶切割，不需要C3[3]。

C5b与末端C成分C6、C7、C8和C9一起组装形成膜攻击复合物（MAC），破坏病原体细胞膜[4]，导致细胞溶解[1]。促炎性过敏毒素C5a则是一种74个氨基酸长的小蛋白，参与多种生理和病理生理过程[5,6]。除了其他作用外，C5a刺激趋化因子的产生[7]，促进免疫细胞趋化[8]，并增强黏附分子的表达[9]。C5a与两种GPCRs结合：C5aR1和C5aR2[10]，两者序列同一性为38.21%（根据Clustal2.1[11]）。在C5a介导的刺激下，C5aR1可与C5aR2形成同源二聚体和异源二聚体[12]，但没有证据表明C5aR2同源二聚体存在[13]。C5aR1主要通过Gαi2和Gα16蛋白以及β-arrestin传导信号，而C5aR2仅募集β-arrestin[9]。C5aR2不能结合G蛋白，因为它缺乏G蛋白偶联所需的某些结构基序，如DRY或NPxxY基序。具体而言，DRY基序中的精氨酸被亮氨酸取代，而NPxxY基序中的酪氨酸被苯丙氨酸取代。此外，还观察到胞内环3（ICL3）中参与G蛋白偶联的苏氨酸和丝氨酸残基的缺失[13]。

已知C5aR1激活可诱导促炎反应[14]，但C5aR2的作用仍有争议。最初认为它仅作为诱饵受体，因为通过结合过量C5a来调节C5aR1信号传导[15]。然而，现在已知C5aR2也传导信号，调节免疫反应，并在不同疾病模型中发挥抗炎或促炎作用。前者已在过敏接触性皮炎[16]或免疫复合物诱导的肺损伤[17]中观察到。C5a激活C5aR2也已证明可上调某些细胞因子和促炎介质的水平[18]。这种促炎功能已在脓毒症[19]、肾炎症及后续损伤[20]和获得性表皮松解症[21]中观察到。C5aR1已被作为治疗靶点，导致小分子拮抗剂avacopan获批[22]，以及HIB210[23]和单克隆抗体avdoralimab[24]的临床开发。C5aR2在药物治疗中受到相对较少的关注。根据ChEMBL[25]，目前没有批准靶向C5aR2的药物。这表明尽管C5aR2信号通路在炎症性疾病中发挥的作用已被新近发现，且作为细胞表面受体具有可及性，但其信号通路在药物治疗中仍被严重低度利用。

迄今为止，已有几种C5aR1结构可用，包括其活化和非活化状态。其中可观察到C末端螺旋H8的两种不同构象。一种是典型的、向外指的构象，见于蛋白质数据银行（PDB）中大多数其他GPCR结构中，例如8JZZ[26]。第二种是倒置构象，指向受体内部，见于非活化态C5aR1中（PDB条目5O9H[27]），类似于在活化态甜味GPCR受体TAS1R2和TAS1R3中观察到的H8构象（PDB条目9NOR和9NOX[28]）。在这些TAS1R2/3的冷冻电镜结构中，TM7向受体外侧弯曲，为倒置H8、螺旋环ICL1和ICL2以及Gα亚基提供更大空间。弯曲的TM7片段与螺旋ICL1之间也存在相互作用，稳定弯曲的TM7。据我们所知，这是PDB中GPCR结构中发现的唯一TM7弯曲构象。同时，除TAS1R2/3外，倒置H8构象仅在非活化态C5aR1中被观察到[27,29]。据推测，当C5aR1受体激活时，H8重新定向至典型构象以与G蛋白偶联[26]。值得注意的是，这两种H8构象都具有两亲性残基组成，而C5aR2的H8序列区域没有两亲性氨基酸组成[30]。我们之前进行了分子动力学（MD）研究，以阐明倒置H8对apo-C5aR1 G蛋白偶联的影响[30]。在该研究中，我们得出结论：尽管其构象不典型，C5aR1中的倒置螺旋在G蛋白偶联的初始步骤之前并未造成明显的空间位阻，在G蛋白偶联前需要重新定向至活化态受体结构8JZZ中观察到的典型H8[25,29, 30, 31],[26,30, 31, 32]。我们还发现C5aR1的ICL3环比C5aR2中的长，这可能允许TM6弯曲以及C5aR1激活和G蛋白偶联过程中H8的更容易重新定向，并可能阻止C5aR2中缺乏G蛋白偶联的H8重新定向，C5aR2仅通过β-arrestin信号通路传导信号[30]。迄今为止，尚无非活化C5aR1中观察到的倒置H8构象作用的明确解释，且仅少数其他研究描述了C5aR2的可能结构模型[33]。在[33]中，C5a–C5aR2–β-arrestin 1系统的500 ns MD模拟结果确定了可能与β-arrestin 1相互作用的受体残基。

在[30]中，我们报告C5aR2中的H8不能像C5aR1和其他GPCR那样呈两亲性或平行于脂双层排列。在该1.5 μs MD模拟研究中，我们观察到，若存在倒置取向的短疏水螺旋H8，它将插入脂双层中并在整个模拟过程中保持稳定，未引起受体去活化或模拟系统的其他破坏[30]。C5aR2中的这一短H8由LPAACHW氨基酸组成内的两个螺旋圈组成。其位置略微垂直于而非平行于膜，且主要位于脂双层的烃侧，仅C末端His（H308）和Trp（W309）残基位于亲水磷酸基团水平[30]。

在此，我们对同时具有倒置H8和典型H8构象的C5a–C5aR2–β-arrestin 1复合物进行了4 μs MD模拟，以阐明H8的存在与构象、其在C5aR2活化态形成中的作用以及其与β-arrestin的相互作用。我们旨在确定这一螺旋的哪种构象——对大多数G蛋白偶联受体而言，无论G蛋白偶联[34]还是β-arrestin募集[35]均至关重要——对于活化态C5aR2更为合理，因为C5aR2与C5aR1在激活信号通路方面存在显著差异。在C5a结合的C5aR2受体复合物的4 μs MD模拟中，我们比较了H8的不同构象如何改变C5aR2与β-arrestin的相互作用。基于我们的模拟，我们发现倒置H8构象不会阻碍β-arrestin与C5aR2的结合，且系统保持稳定，维持活化态β-arrestin构象。然而，我们观察到倒置H8诱导TM7弯曲，这一现象仅在TAS1R2 PDB结构中被观察到，而未出现在任何其他GPCR结构中。

相比之下，典型H8在整个模拟过程中变得更加无序，在一种情况下导致完全解旋。具有典型H8的整个模拟系统容易发生更大的构象变化，甚至包括β-arrestin的去活化。这些观察结果表明，C5aR2中的H8并非以典型构象存在。相反，H8的一个短非极性序列片段LPAA——无论以螺旋形式作为倒置H8的一部分，还是仅以螺旋圈或无规则卷曲构象——似乎以不同倾向性被占据。这一LPAA序列片段在所有模拟中对脂双层显示出亲和力，可能作为β-arrestin募集期间受体的稳定锚定。这可能解释C5aR2独特的信号传导方式，即完全由β-arrestin介导。

## 章节片段

### 方法

使用MODELLER版本10.5[36]生成C5a–C5aR2–β-arrestin 1复合物同源模型的两种不同版本：一种具有倒置H8，另一种具有典型H8。目前尚无C5aR2的实验测定结构，且其H8序列为非两亲性的，表明稳定典型螺旋H8在该受体中可能不会必然形成。因此，我们模拟了在密切相关的旁系同源物C5aR1中观察到的两种H8构象，以评估H8是否能……

### 结果

为每种H8构象准备了三个模拟重复组（见方法）。采用8JZZ PDB结构[26]构建不含H8的活化态受体结构。随后根据8JZZ或5O9H PDB结构分别添加典型或倒置H8（补充图S3，左下面板）。8JZZ包含整个结合Go蛋白的人C5a-desArg与人C5aR1复合物，而5O9H包含非活化态、热稳定的人C5aR1复合物……

### 讨论

C5aR2仅通过β-arrestin介导的通路传导信号，应形成与β-arrestin的稳定复合物，使其能够内化[71]。因此，我们认为C5aR2与β-arrestin复合物中β-arrestin的"悬挂构象"不太可能，C5aR2的C末端甚至比C5aR2更短。C5aR2具有典型H8的可能性也很小，而其在脂双层细胞内侧具有任何H8（类似于非活化态CXCR4）的可能性更小。

我们基于参考文献66进行此研究；66。CRediT作者贡献声明：Paulina Dragan：撰写—审稿与编辑，撰写—初稿，可视化，验证，软件，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理，概念构思。Dorota Latek：撰写—审稿与编辑，撰写—初稿，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法论，调查研究，资金获取，形式化分析，数据管理，概念构思。致谢：我们感谢波兰的高性能基础设施PLGrid（HPC中心：ACC Cyfronet AGH），在计算资助编号PLG/2024/017063和PLG/2025/018222下提供计算机设施和支持。本工作未接受外部资金支持。所有作者均不存在与实际或感知内容相关的利益冲突。Paulina Dragan | Dorota Latek，华沙大学化学系，华沙，波兰