《Journal of Proteomics》：Gestational age-associated differences in amniotic fluid extracellular vesicle-enriched preparations during mid-pregnancy: an exploratory proteomic study
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•在19周和24周时，使用DIA蛋白组学技术比较了富集了EV的样本。•共对8份羊水样本中的3321种蛋白质进行了定量分析。•初步和KNN敏感性分析发现了698个候选基因。•19周富集样本中主要呈现出与代谢/消化和顶端细胞相关的蛋白质注释。•24周富集样本中则以蛋白酶体相关的蛋白质
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在19周和24周时，使用DIA蛋白组学技术比较了富集了EV的样本。
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共对8份羊水样本中的3321种蛋白质进行了定量分析。
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初步和KNN敏感性分析发现了698个候选基因。
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19周富集样本中主要呈现出与代谢/消化和顶端细胞相关的蛋白质注释。
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24周富集样本中则以蛋白酶体相关的蛋白质注释为主。
引言
羊水是胎儿在子宫内的直接环境，其中包含来自胎儿和妊娠多种组织的分子成分，包括皮肤、呼吸道、胃肠道、泌尿系统、羊膜和胎盘。随着妊娠的进展，羊水的成分会发生变化，这为了解胎儿和子宫内的环境演变提供了信息[1]。羊水中的细胞外囊泡（EVs）是纳米级的膜包裹颗粒，能够运输蛋白质、脂质和核酸，可能在妊娠环境中的细胞间通讯中发挥作用[2],[3]。由于这些囊泡内的分子物质被脂质双层选择性地包裹和保护，因此源自羊水的EVs（AF-EVs）为研究胎儿和妊娠生物学提供了潜在的宝贵信息[4]。
羊水蛋白组学研究已有近二十年的历史。早期的基于质谱的技术生成了人类羊水的广泛蛋白质目录，展示了羊水蛋白组的复杂性和动态特性[5],[6]。最近的大规模研究进一步表明，在正常妊娠期间，羊水的总蛋白质含量会随妊娠年龄显著变化[7],[8]。羊水蛋白组也会在不同的妊娠状态下发生变化，例如足月分娩时[9]。综上所述，妊娠年龄和妊娠环境是决定羊水总蛋白质组成的关键因素，在解释源自羊水的生物标志物候选物时必须考虑到这些因素[4]。
与总羊水相比，富集了EV的样本可能会提供更多关于囊泡相关膜结构、囊泡内物质、囊泡生物发生过程以及可能的细胞来源的信息。关于AF-EVs的综述强调了它们的生物学意义以及分离、鉴定和临床应用所面临的技术挑战[3],[10]。然而，正常妊娠中期AF-EV蛋白组的变化仍不如总羊水蛋白组的变化那么明确。最近的一项研究表明，简单妊娠和足月妊娠之间的AF-EV特性和蛋白质成分存在差异[11]，这支持了AF-EV组成会随妊娠年龄演变的观点。尽管如此，在中期妊娠期间进行密集采样的数据仍然有限，目前尚不清楚AF-EV蛋白组模式是反映了总羊水成分的变化，还是揭示了与囊泡相关的特定模块。
妊娠中期是一个动态阶段，其特征是胎儿持续生长、上皮表面重塑、器官成熟和妊娠组织重构。在此期间，羊水的成分会随着妊娠的进展而变化，这意味着即使是在间隔较短的采样窗口内，也可能导致基于羊水的蛋白组学研究中的生物变异[6],[7],[8]。在这项研究中，选择19周和24周作为样本时间点，是因为在这两个时间点有临床指征的羊膜穿刺样本，并且这些样本都有完整的临床随访数据。因此，这两个组应该被视为妊娠中不同阶段的代表性样本，而不是独立的发育阶段。实验也表明，来自妊娠中期羊水的细胞外囊泡携带生物活性物质[12]，这进一步证明了在中期妊娠期间研究AF-EV蛋白质成分的相关性。
先前的研究已经记录了妊娠期间总羊水的变化，以及妊娠中期与足月之间AF-EV成分的差异[7],[8],[11]。为了探讨是否也能在更短的妊娠中期间隔内检测到类似的蛋白组变化，我们使用了一致的富集方法和独立于数据的获取（DIA）定量蛋白组学工作流程，分析了在妊娠19周和24周时采集的富集了EV的样本，这些样本来自妊娠过程正常且胎儿染色体结果正常的妊娠。我们的目标是识别这些采样点之间的差异，并为未来的验证确定蛋白质候选物。
章节摘要
研究设计和样本收集
这项探索性研究包括了在妊娠大约19周（19W组；n=4）和24周（24W组；n=4）时进行临床指征性羊膜穿刺所获得的羊水样本。相关妊娠的详细临床信息见表1和表2。只有当胎儿超声检查结果正常，并且通过常规核型分析和染色体微阵列排除了胎儿染色体异常时，这些妊娠才会被纳入研究。
羊水来源的细胞外囊泡富集样本的特征分析
透射电子显微镜观察到了膜包裹的囊泡样结构（图1A）。Western blot检测到了与EV相关的标记物ALIX、TSG101、CD63和CD9，而ApoA1作为脂蛋白相关对照则信号较弱（图1B）。动态光散射（DLS）显示主要的大小分布峰位于100–200 nm范围内（图1C）。这些数据共同证明了从人羊水中成功回收了富集了EV的物质，但并未证实EV的纯度或进行全面表征。
19周和24周AF-EV富集样本的全局蛋白组学分析及探索性分离
讨论
在这项探索性的横断面研究中，大约在19周和24周时收集的AF-EV富集样本显示出不同的蛋白质丰度模式。由于每个组只有四个生物学样本，因此差异丰度结果、富集效果和网络分析应被视为特定于数据集的，并用于生成假设，而非具有普遍适用性的结论。
使用符合条件的2611种蛋白质作为分析范围，对19周样本进行了分析...
结论
通过DIA蛋白组学技术，我们发现了在19周和24周时收集的AF-EV富集样本中不同的蛋白质丰度模式，并筛选出了698个一致的、具有潜在生物学意义的候选蛋白。基于所有蛋白质的过度表达分析显示，在19周组中主要出现了与代谢/消化和顶端/刷状缘相关的蛋白质注释，在24周组中则主要出现了与蛋白酶体相关的蛋白质注释。这些未经调整的富集结果仅具描述性...
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在手稿准备过程中，作者仅使用Gemini 3.0 Pro工具进行了语言润色和可读性提升。所有的实验设计、数据分析、统计解释、路径分析和科学结论均由作者独立完成、审查和验证。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了修改，并对整个手稿的内容负全责。
作者贡献
HX、TL和MZ负责数据管理、组学数据分析以及初稿的撰写。XL、QG和YG负责EV的富集和AF-EV富集样本的表征。ZG和HW负责数据可视化。LG、HL和SL参与了临床样本的采集。DW构思并设计了整个研究，并对手稿进行了审查。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。
CRediT作者贡献声明
Hai Xiao：撰写——初稿；正式分析；数据管理。Tao Li：撰写——初稿；正式分析；数据管理。Mengting Zhang：撰写——初稿；正式分析；数据管理。Xue Lv：验证。Yue Gao：验证。Qiannan Guo：验证。Zhenglong Guo：可视化。Hongdan Wang：可视化。Liangjie Guo：研究调查。Hongyan Liu：研究调查。Shixiu Liao：研究调查。Dong Wu：撰写——审阅与编辑；项目管理。
伦理审批和参与同意
本研究已获得中国河南省人民医院伦理委员会的批准（批准编号：2019-134）。所有参与者都签署了书面知情同意书。
资助
本项工作得到了国家卫生委员会出生缺陷预防重点实验室开放研究基金（资助编号：NHCKLBDP2024013）、河南省科技攻关计划（资助编号：252102311131）、河南省医学科技攻关计划——省部共建重点项目（资助编号：SBGJ202402005）以及河南省医学科学研究项目（资助编号：LHGJ20240001、LHGJ20240004、LHGJ20250008）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本研究报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
Hai Xiao|Tao Li|Mengting Zhang|Xue Lv|Yue Gao|Qiannan Guo|Zhenglong Guo|Hongdan Wang|Liangjie Guo|Hongyan Liu|Shixiu Liao|Dong Wu
