通过飞秒激光原位快速制备亚100微米微结构用于稀有细胞的相关成像

《Small》：Rapid Fabrication of Sub-100 μm Microstructures In Situ via Femtosecond Laser for Correlative Imaging of Rare Cells

　　

相关光镜、电镜和离子显微镜为单细胞分析提供了强大的多尺度框架，但由于不同的样品制备要求，整合这些方法仍然具有挑战性，特别是对于稀有细胞群体，低产量和样品损失限制了成功率。在此，研究人员引入了一种飞秒（fs）激光烧蚀策略，能够实现快速材料去除和在树脂包埋的生物基底上定向制造三维（3D）亚100微米（μm）微结构。该工作流程使用流式分选的小鼠CD4+ T细胞亚群进行验证：调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）。在树脂包埋后，利用飞秒激光烧蚀制造了一个半网格几何结构，该结构包含一个微柱阵列（尖端直径约30 μm），每个微柱内含单个或多个目标细胞，同时将激光诱导损伤限制在约3 μm。研究人员通过使用混合飞秒激光/聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）工作流程制备电子透明膜，并对位于制造的微柱尖端的单个细胞进行三维FIB-SEM断层扫描，从而验证了该方法。这些分析揭示了保存完好的亚细胞结构，并实现了T细胞亚群之间的直接超微结构比较。该网格几何结构也与额外的下游分析技术兼容，为纳米级化学分析拓展了机会。总体而言，这项工作建立了一条实用的途径，将精密微纳工程与高分辨率相关成像相结合，用于对稀有和有限细胞群体进行稳健的分析。

论文解读：飞秒激光辅助制备微结构用于稀有T细胞亚群的多模态相关成像

一、 研究背景与问题

现代细胞生物学研究越来越依赖于多模态相关显微成像技术，例如结合荧光标记的相关光镜和电镜（CLEM），以及能够提供三维（3D）结构信息的聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）断层扫描。将这些技术整合，可以在从整体生物体到单个分子的不同尺度上获得关联数据。然而，将这些方法推向更高分辨率的化学成像方法，如原子探针层析技术（APT），面临着巨大挑战。主要的瓶颈在于不同成像模态对样品制备的要求截然不同，尤其是严格的几何形状需求：例如，（扫描）透射电子显微镜（(S)TEM）需要几百纳米厚的超薄切片，而APT则需要尖端直径小于80纳米的尖锐针尖。传统的样品制备方法，如超薄切片术和基于FIB的定点加工，在处理稀有细胞时存在明显不足。对于像CD4⁺ T细胞亚群这样的稀有细胞，经过流式分选后通常只能获得有限的细胞数量（约5×10⁴–5×10⁵个），而在后续的染色、包埋等过程中又会损失大量细胞，最终能用于成像的细胞极少，导致成功率低下。因此，迫切需要一种快速的方法，能够在细胞分选后定位这些被包埋在基质中的稀有细胞，并将其塑造成适合成像和断层扫描所需的亚100微米几何结构。

二、 研究方法与技术路线

为解决上述问题，研究人员提出并验证了一套基于飞秒（fs）激光烧蚀的样品制备工作流程。该工作流程的关键技术方法包括：

1. 1.
   细胞分选与包埋：从小鼠组织中分离CD4⁺ T细胞，并通过流式细胞术分选出调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）亚群。随后将分选的细胞分别包埋在环氧树脂中。
2. 2.
   精密锯切：使用精密锯从细胞富集区域切割出厚度约为300–500微米的薄片。
3. 3.
   飞秒激光微纳加工：采用波长为515 nm、脉冲宽度为184.2 fs的飞秒激光系统，在树脂薄片上通过逐层扫描的策略，快速制造出包含目标细胞的亚100微米微柱阵列。研究人员优化了激光参数（如通量0.72 J/cm2、扫描速度300 mm/s），以实现可控的材料去除并将热影响区（HAZ）损伤限制在约3 μm。
4. 4.
   混合激光-离子束精修：将飞秒激光加工的微柱作为初始基底，进一步利用聚焦离子束（FIB）进行精修，制备成适用于(S)TEM成像的电子透明薄膜（厚度<200 nm）或用于FIB-SEM断层扫描的截面。
5. 5.
   多模态成像与分析：利用扫描透射电子显微镜（STEM）进行超微结构成像，并采用FIB-SEM“切片-观察”技术获取3D数据集，结合深度学习进行图像分割和3D重建，以定量分析细胞亚群间的差异。

三、 研究结果

2.1 利用飞秒激光3D制造亚100微米微柱

通过在纯环氧树脂上进行单脉冲烧蚀实验，确定了树脂的烧蚀阈值通量（F_th）为1.2 J/cm2。在低于阈值的通量（0.72 J/cm2）下进行多脉冲辐照，实现了可控的材料去除，材料去除率（MRR）约为11–18×10? μm3/s，制造一个微柱仅需约4分钟。制造的微柱呈现锥形几何，其尖端直径可保持在亚100微米范围内（约34.5 μm），且纵横比低于4时效果最佳。

2.2 在细胞富集区域进行靶向飞秒激光微柱阵列制造

研究人员将优化的激光参数应用于含有T细胞的树脂切片。首先通过光学显微镜识别细胞富集区域，然后在扫描电镜（SEM）下定位目标细胞，并沉积铂（Pt）帽和刻蚀基准标记以精确引导激光加工。成功制造了间距为500 μm的微柱阵列，形成了定制的半网格几何结构。FIB截面显示，位于微柱中心区域的细胞未观察到可见的激光损伤，表明其结构保存完好。

2.3 通过混合激光-离子束加工快速制备TEM薄膜用于T细胞亚群超微结构成像

在激光制造的微柱尖端，采用标准的H-bar FIB-TEM薄膜制备协议，制造了宽度约10 μm、厚度小于200 nm的电子透明薄膜。STEM成像清晰地显示了多个Treg细胞的超微结构，包括细胞核（N）、细胞质（C）、染色质（Chr）和微绒毛（m）。与通过传统超薄切片制备的对照样品相比，细胞形态具有可比性，证明了该工作流程能够保护精细的细胞结构。

2.4 单个T细胞的三维成像与超微结构分析

研究人员对激光制造的微柱上的单个Treg和Teff细胞进行了FIB-SEM断层扫描和3D重建。通过对细胞核、细胞质和线粒体进行分割，获得了定量数据。结果显示，与Treg细胞相比，Teff细胞表现出显著更低的核面积分数和核体积分数，表明其细胞质体积更大。此外，Teff细胞中观察到明显的线粒体簇，这与它们依赖糖酵解的代谢特征一致，而Treg细胞则主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）。

四、 讨论与结论

讨论总结：本研究建立的飞秒激光烧蚀策略为稀有细胞亚群的样品制备提供了一个快速、通用的解决方案，有效解决了传统方法耗时长、成功率低的主要瓶颈。该工作流程不仅成功制备了用于(S)TEM成像的超薄薄膜，还促进了针对目标细胞的3D FIB-SEM断层扫描，并揭示了Treg和Teff细胞在亚细胞形态上的特异性差异。研究也指出了当前方法的局限性，例如3D数据集规模有限、染色对比度对线粒体识别的挑战以及微柱的锥形几何限制了高纵横比结构的制造。激光诱导的损伤层平均宽度约为3 μm，通过计算，微柱中心约28.5 μm的区域（约占最终微柱直径的83%）是安全的细胞保存区域。未来工作将侧重于优化激光参数、探索低温条件下的激光烧蚀以接近天然状态分析样品，以及结合X射线断层扫描和人工智能（AI）进行自动化目标识别和路径规划，以进一步提高通量和效率。

研究结论翻译：研究人员提出了一种用于分析稀有和有限细胞群体的成像策略。该方法利用飞秒激光处理，在特定位点制造可定制的亚100微米微柱。这些微柱按照传统的TEM半网格布局排列，使其能与光镜、电镜和离子显微镜以及断层扫描兼容，从而对目标细胞进行相关分析。通过系统优化激光功率、扫描速度和脉冲能量，实现了精确加工并将热损伤降至最低。研究人员以树脂包埋的T细胞亚群（调节性和效应性）为模型系统，在优化的条件下演示了该方法。在混合激光-FIB工作流程中，在目标位置生成了具有精确几何形状的激光制造微柱阵列，将单个细胞定位在微柱尖端。随后用FIB将这些微柱塑造成(S)TEM薄膜用于超微结构表征。此外，对激光制造的微柱进行了FIB断层扫描，以实现对T细胞特征和亚型特异性形态差异的3D分析，证实了该工作流程的有效性。激光烧蚀引起的损伤被限制在大约3微米。与传统技术相比，该方法将制备时间缩短了三到五倍，确保了稀有生物材料的有效利用，并显著提高了稀有细胞类型的高分辨率相关显微成像的成功率。该论文发表于《Small》。