pKa工程化近红外荧光探针用于动脉粥样硬化斑块氧化应激的灵敏成像

《Smart Molecules》：pKa engineering of a near-infrared fluorescent probe for sensitive imaging of oxidative stress in atherosclerotic plaques

　　

活性氧（ROS）是动脉粥样硬化进展中的关键介质，因此ROS成像对于评估斑块中的氧化应激具有重要价值。然而，大多数可激活荧光探针在生理条件下的荧光增强有限，因为其荧光团在中性pH下电离不充分，导致信号输出弱且灵敏度低。为解决这一问题，研究人员开发了一种pKa工程策略，通过在酚羟基邻位引入吸电子氟原子来构建荧光团DCM-2F-OH。二氟取代将pKa降至6.0，使得在生理pH下能够完全电离并产生强近红外荧光发射。进一步引入硼酸酯触发基团，得到了可激活的ROS探针DCM-2F-B。DCM-2F-B对ROS表现出12.8倍的荧光开启响应，显著高于非氟化类似物（2.5倍），同时具有低检测限（0.03 μM）和低细胞毒性。该探针成功可视化了脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中的内源性ROS，并检测到载脂蛋白E敲除（ApoE^?/?）小鼠主动脉瓣组织中的ROS水平升高，与组织病理学分析一致。这项工作表明，pKa工程是改善生理条件下可激活荧光探针的有效策略，并为心血管疾病中氧化应激成像提供了有用工具。

**论文解读**

**一、研究背景与问题**

动脉粥样硬化（AS）是心肌梗死和脑卒中等心血管疾病的主要病理基础。斑块的进展与不稳定性与炎症微环境中的氧化应激密切相关，其中活化的巨噬细胞产生过量的活性氧（ROS）。升高的ROS水平不仅损伤血管内皮细胞，还促进氧化型低密度脂蛋白形成和斑块破裂。因此，直接可视化AS斑块内的ROS对于早期诊断和风险评估具有重要意义。近红外（NIR）荧光成像因其低组织自发荧光、较深的组织穿透和实时成像能力而备受关注。然而，在生理条件下开发高灵敏度的ROS可激活NIR探针仍是一个重大挑战。

目前已有多种基于分子内电荷转移（ICT）荧光团的可激活荧光探针被开发用于ROS成像。其中，二氰亚甲基-4H-吡喃（DCM）类荧光团因其合成简便、光稳定性好和斯托克斯位移大而受到青睐。然而，传统DCM-OH荧光团的高pKa值（约9.1）限制了其实际应用。由于生理环境通常维持pH 7.4，这些荧光团大部分保持质子化、非荧光状态，即使ROS响应触发基团被切断，荧光输出仍然很弱。这种在生理pH下电离不充分的问题严重限制了荧光“开启”效率和成像灵敏度，使现有探针无法精确检测AS病变中的氧化应激。

**二、研究目的与意义**

为解决上述问题，研究人员采用了pKa工程策略，在酚羟基邻位引入吸电子氟原子，构建了低pKa荧光团DCM-2F-OH。二氟取代将pKa降至6.0，使得在生理pH下几乎完全电离并增强荧光发射。基于该优化荧光团，进一步引入硼酸酯基团作为ROS响应触发基团，开发了可激活NIR探针DCM-2F-B。该探针对ROS表现出显著增强的荧光响应，能够高对比度可视化活化巨噬细胞中的内源性ROS以及ApoE^?/?小鼠主动脉瓣中的病理性ROS积累。这项工作证明了pKa工程是改善生理条件下可激活荧光探针的有效策略，并为心血管疾病中氧化应激成像提供了有前景的工具。论文发表在《Smart Molecules》。

**三、主要技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：通过Knoevenagel缩合和亲核取代反应合成探针DCM-2F-B及非氟化对照探针DCM-B；利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱表征探针的光谱响应性能；采用密度泛函理论（DFT）计算研究卤素取代对分子轨道能级和分子静电势的影响；使用高分辨质谱（HRMS）验证ROS触发机制；通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法评估细胞毒性；利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行细胞成像；使用ApoE^?/?小鼠模型（每组3只，n=3）获取主动脉瓣和三尖瓣组织，进行组织病理学染色（H&E、Masson、α-SMA、Oil Red O）、免疫荧光染色（CD31、TNF-α、CD68）及二氢乙啶（DHE）染色，并进行离体组织荧光成像。

**四、研究结果**

**2.1 pKa工程的ROS传感机制与性能**

通过光谱实验，研究人员发现DCM-2F-B在H₂O₂处理后吸收峰从422 nm红移至490 nm，伴随溶液颜色由淡黄色变为粉红色，表明硼酸酯被氧化裂解并释放DCM-2F-OH，恢复D?π?A结构。非氟化对照DCM-B几乎无吸收位移，说明氟取代对恢复ICT过程至关重要。荧光滴定实验显示，DCM-2F-B对H₂O₂的检测限为0.03 μM，荧光开启倍数约为12.8倍，而DCM-B仅有2.3倍。pH依赖性实验表明DCM-2F-OH的pKa为6.0，远低于DCM-OH的9.1，从而在生理pH下实现近完全电离。DFT计算和分子静电势分析证实氟取代降低了前线轨道能级并增加了酚氧原子周围电子密度，有利于酚氧负离子的稳定和去质子化，而硼酸酯保护则抑制ICT，保持探针处于关闭状态。

**2.2 响应特异性和生物稳定性**

高分辨质谱（HRMS）证实DCM-2F-B与H₂O₂反应后生成m/z=347.0641的峰，与[DCM-2F-OH–H]^?理论值347.0627一致，确认了氧化裂解机制。选择性实验表明，仅H₂O₂能引起约16倍的荧光增强，其他干扰物（无机盐、酶、氨基酸、疾病相关生物分子）均无明显响应。稳定性实验显示，探针在宽pH范围、不同盐浓度以及含10%胎牛血清的DMEM培养基中孵育12 h后荧光均保持低水平，说明其在复杂生物介质中稳定。光稳定性实验以吲哚菁绿（ICG）为对照，DCM-2F-B在连续照射20 min后保留约37%初始吸收，光漂白半衰期约12 min，产物DCM-2F-OH约20 min，均远长于ICG（约0.5 min），表明其适合长期生物成像。

**2.3 活细胞中内源性ROS的体外成像与定量检测**

在RAW264.7巨噬细胞中，DCM-2F-B被细胞摄取后荧光强度在0.5 h内逐渐增加并达到平台，因此选择1 h作为后续孵育时间。MTT实验显示10 μM浓度下细胞存活率>93%，20 μM时>85%，说明细胞毒性可忽略。脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞呈现强荧光，而ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理后荧光显著抑制，证明信号源于ROS激活。进一步实验表明，即使探针孵育30 min，外源性H₂O₂刺激仍能产生约24倍荧光增强；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）诱导的内源性ROS产生约12倍增强；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂夹竹桃麻素（apocynin）将信号降至约4倍，NAC则完全抑制至基线水平，验证了探针在不同刺激模型下的稳健性。外源性H₂O₂刺激实验显示浓度依赖性荧光增加，在0–200 μM范围内线性良好（R2=0.97），检测限为6.5 μM，证明其可用于活细胞内ROS的定量分析。

**2.4 动脉粥样硬化斑块组织的离体ROS成像**

在ApoE^?/?小鼠模型中，组织病理学分析证实了晚期动脉粥样硬化病变：H&E染色显示明显炎症细胞浸润，Masson和Oil Red O染色显示胶原沉积和脂质积累，α-SMA染色显示平滑肌细胞含量减少，表明血管壁重塑和斑块不稳定。免疫荧光染色显示TNF-α和CD68信号强，提示明显炎症和巨噬细胞浸润；DHE染色证实病变组织中ROS水平显著升高。离体组织成像中，主动脉瓣组织与DCM-2F-B孵育后荧光增强约16倍，三尖瓣组织约13倍。NAC预处理后，两种组织的荧光均降至近基线水平（p<0.0001），证明荧光激活由升高的ROS特异性驱动。

**五、总结与讨论**

本研究开发了pKa工程化的可激活荧光探针DCM-2F-B，通过在酚羟基邻位引入吸电子氟原子将荧光团pKa降至6.0，使其在生理pH下高效电离并产生强NIR荧光。该探针对H₂O₂表现出12.8倍的荧光开启响应，检测限为0.03 μM。在AS小鼠模型中，DCM-2F-B能够在主动脉瓣组织中清晰可视化升高的ROS水平，荧光增强约16倍，与组织病理学和ROS特异性染色分析一致。

**研究结论**：总之，研究人员开发了一种pKa工程的可激活荧光探针DCM-2F-B，用于动脉粥样硬化斑块中ROS的灵敏成像。通过引入吸电子氟原子，有效降低了荧光团pKa，使探针在生理条件下能够高效电离并产生强荧光输出。该探针对H₂O₂表现出12.8倍的荧光开启响应，检测限为0.03 μM。在AS小鼠模型中，DCM-2F-B能够清晰显示主动脉瓣组织中升高的ROS水平，较对照组织约16倍荧光增强，与组织病理学和ROS特异性染色分析一致。这些结果证明其在复杂病理环境中进行ROS成像的可靠性能。总体而言，这项工作为心血管疾病中的ROS成像提供了稳健的分子工具，并强调pKa工程是优化可激活荧光探针的通用策略。该策略可能促进用于深组织和疾病靶向成像的高级探针的开发。