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背景：细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），包括外泌体，已被证明是细胞间通讯的基本调节因子，并在治疗和诊断方面展现出日益重要的前景。尽管过去二十年EV研究显著扩展，该学科植根于更长的观察、概念进展和技术创新历史，这些逐渐转变了人
背景：细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），包括外泌体，已被证明是细胞间通讯的基本调节因子，并在治疗和诊断方面展现出日益重要的前景。尽管过去二十年EV研究显著扩展，该学科植根于更长的观察、概念进展和技术创新历史，这些逐渐转变了人们对这些纳米颗粒的理解。本综述提供了关于EV生物学演变的历史视角，强调了塑造当代领域的里程碑式发现、研究人员和社区推动的倡议。
方法：研究人员进行了一项叙述性综述，以评估EV研究的主要里程碑，从早期对无细胞颗粒物质的描述，到现代在EV生物学、标准化和转化医学方面的进展。重点特别放在重新定义EV生物学重要性的标志性研究，以及增强可重复性和方法学严谨性的国际框架的发展上。
结果：早期研究将EV样颗粒描述为可沉淀的血浆成分或细胞废弃物，最终以Peter Wolf在1967年对“血小板尘埃”的描述达到顶峰。随后Crawford、Johnstone、Stahl、Raposo、Ratajczak等人的研究确立了EV作为生物活性结构，参与囊泡生物发生、抗原呈递和遗传信息的水平转移。颗粒表征、分子谱分析和成像方法的进展进一步证明EV是蛋白质、脂质、代谢物和核酸的复杂载体，能够介导多种生理和病理机制。与此同时，国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）的成立和相继发布的MISEV指南为该学科的标准化、透明度和可重复性提供了关键基础。
结论：EV研究的历史反映了从对知之甚少的细胞外颗粒的观察，到认识到EV是生物通讯的关键调节因子和潜在治疗系统的显著转变。随着技术能力、标准化工作和转化应用的持续发展，EV有望在精准医学的未来中发挥越来越重要的作用。
论文主体部分总结
1 引言
1.1 细胞外囊泡：定义与分类
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是几乎所有细胞类型分泌的膜包裹纳米颗粒，直径约30–2000 nm，根据其分子货物、大小和生物发生方式分为三类：外泌体（exosomes，30–150 nm）、微囊泡（microvesicles, MVs，也称外颗粒，50–1000 nm）和凋亡小体（apoptotic bodies，500–2000 nm）。需要指出，这些大小范围存在重叠，仅凭大小难以精确定义亚型。所有EV均具有脂质双层结构，含有蛋白质、代谢物、核酸和脂质等生物活性分子，其中RNA（如mRNA、miRNA和其他非编码RNA）因其能够通过向靶细胞转移功能性遗传信息而受到特别关注。EV的货物反映了来源细胞的类型和生理状态。主要亚型在生物发生上存在差异：外泌体起源于内体系统，通过内体膜的内出芽形成腔内囊泡，并在多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外空间；微囊泡通过细胞膜的外出芽和分裂产生；凋亡小体在细胞凋亡过程中作为膜碎片释放，包含核物质和细胞器成分。
1.2 细胞外囊泡：生物通讯者和治疗系统
EV具有低免疫原性、天然生物相容性和递送多种治疗性货物的能力，因此被视为靶向药物递送的潜在系统。其表面成分（如糖缀合物、脂质和蛋白质）参与组织靶向关联并影响生物分布。EV通过与靶细胞的多种相互作用方式发挥功能：通过配体-受体结合触发细胞内信号通路；通过膜交换向靶细胞传递膜蛋白和受体；通过膜融合、巨胞饮、吞噬或内吞作用被摄取，实现生物活性货物的细胞内转移和分子信息的水平转移。
1.3 本综述的范围和目标
本综述旨在从历史角度分析EV研究的发展，追溯使EV从被认为的细胞废弃物转变为细胞间通讯关键调节因子的里程碑式发现，并总结社区推动的标准和资源（如国际细胞外囊泡学会（ISEV）指南、EV-TRACK、MIFlowCyt-EV、ExoCarta和Vesiclepedia）如何增强该领域的可重复性和转化进展。
2 方法
本研究采用叙述性综述而非系统评价。通过迭代检索生物医学文献，并参考重要综述、共识声明和历史记录，筛选具有以下特征的研究：（a）对理解EV生物学具有历史意义；（b）引入重大概念或技术突破；（c）对后续研究产生显著影响；（d）对社区标准或方法学发展具有持久影响。
3 “EV-erything”的历史
3.1 EV研究的起源：凝血与无细胞颗粒（1666–1940年代）
最早的观察可追溯到1666年Marcello Malpighi对心脏血栓和体外血凝块的研究，描述了凝血血液中的纤维状网状结构。1940年代，Erwin Chargaff和Randolph West发现通过高速离心从血浆中提取的颗粒组分具有促凝血功能，将沉淀重新加入血浆可显著缩短凝血时间。这提供了非细胞颗粒具有生物活性的早期证据。
3.2 血小板尘埃的发现（1956–1967）
1967年，Peter Wolf在评估无血小板血浆时发现一种促凝血颗粒物质，既非完整细胞也非可溶性血浆因子，他将其称为“血小板尘埃”。这种颗粒可通过高速离心沉淀，去除沉淀会降低凝血酶生成能力，而重悬沉淀可恢复功能。Wolf还使用密度梯度超速离心和电子显微镜（electron microscopy, EM）证实这些颗粒来源于血小板，是富含脂质的膜结构。
3.3 超越血液：跨生物界的EV发现
3.3.1 植物细胞外囊泡
1967年，Halperin和Jensen在植物细胞中观察到囊泡样实体，提示囊泡依赖性输出可能是跨物种的保守生物学途径。后来Regente等人从向日葵质外体液中分离出EV，并证明其含有参与细胞间通讯的蛋白质。
3.3.2 真菌细胞外囊泡
对真菌病原体的研究发现，膜包裹的囊泡可以穿过真菌细胞壁递送毒力相关分子，打破了此类实体仅存在于动物细胞中的假设，表明囊泡依赖性释放是保守的分子输出方式。
3.3.3 基质囊泡与发育生物学
1969年，Anderson在软骨中发现基质囊泡，提出其在骨形成过程中促进矿化传播，将囊泡结构的功能扩展至组织发育和稳态。
3.4 Crawford对EV的结构表征
1971年，Neville Crawford从无血小板血浆中分离出可沉淀组分，利用EM、免疫学和生物化学分析证明这些颗粒具有明确膜包被结构，包含血小板来源的蛋白质、ATP和脂质相关成分。这是最早的超微结构证据，表明先前在凝血研究中描述的颗粒是组织化的生物结构，而非无定形碎片。
3.5 Rose Johnstone与EV生物学的诞生
Rose Johnstone在研究网织红细胞成熟过程中，意外发现细胞向细胞外空间分泌小膜囊泡。她的工作表明囊泡分泌是一种受调控的细胞机制，而非被动副产物，为EV是细胞膜转运和重塑的产物提供了概念基础。
3.6 EV生物发生的发现
3.6.1 Johnstone的网织红细胞研究
1983年，Johnstone等人利用成熟的绵羊网织红细胞，从条件培养基中提取囊泡，发现转铁蛋白受体和其他膜蛋白在分泌囊泡中富集，表明膜组分被主动分选至囊泡。
3.6.2 Stahl与多泡体
几乎同时，Stahl等人利用EM和定量内吞实验，在鼠网织红细胞中观察到转铁蛋白受体定位于多泡内体区室，并记录了这些区室与细胞膜融合后分泌腔内囊泡。
3.7 废物处理范例
在1980年代末至1990年代，Johnstone进一步证明网织红细胞成熟过程中分泌的EV含有选择性减少的膜蛋白和转运功能，提出EV分泌是清除特定细胞内容物的选择性过程。1991年，她在演讲中提出外泌体是脱落过时膜蛋白的主要途径，因此EV长期被视为细胞废弃物清除机制。
3.8 从废物处理到细胞间通讯
3.8.1 Raposo与免疫通讯
1996年，Maria da Gra?a Raposo证明B淋巴细胞释放携带功能性主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）II类分子的EV，能够参与抗原呈递。这一发现将EV从废物处理转变为免疫通讯的动态参与者。
3.8.2 Ratajczak与干细胞来源囊泡
2006年，Ratajczak等人证明非恶性活化细胞分泌的囊泡可通过转移表面配体、黏附分子和受体影响靶细胞行为，并提出EV是细胞间通讯的介质。后续研究显示干细胞来源的微囊泡可向靶细胞转移蛋白质和mRNA，导致可测量的功能和表型改变，确立了水平基因转移的新范式。
4 ISEV标准化：MISEV指南
4.1 ISEV的成立
随着EV研究的快速扩张，方法、命名和实验策略的异质性成为挑战。2005年Rose Johnstone在蒙特利尔组织了首次国际EV会议，2010年牛津方法论研讨会和2011年巴黎国际会议促成Jan L?tvall提出建立国际细胞外囊泡学会（ISEV）。ISEV于2011年成立。
4.2 MISEV指南的发展
ISEV最具影响力的贡献是最小信息要求（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles, MISEV）指南。2014年发布第一版，提出EV分离、表征、定量和功能分析的最低要求。随后在2018年和2023年更新，MISEV2018鼓励使用基于可测量特征（如大小、密度、分子货物或细胞来源）的操作性术语，并强调表征方法、共分离污染物检测和实验局限性报告。
4.3 EV标准化的挑战
该领域面临实验可重复性、标志物检测和命名不一致等挑战。EV一词常被用于描述多种类型的囊泡，而缺乏内体来源的确凿证据，这种异质性导致语义模糊。
4.4 支持EV研究的社区资源
MISEV指南是灵活的演化性建议。EV-TRACK提供报告框架以增强方法学透明度；MIFlowCyt-EV为流式细胞术评估EV制定最低报告要求；Vesiclepedia和ExoCarta是重要的EV分子数据库。ISEV还建立了特别兴趣小组（Special Interest Groups, SIGs），促进知识交流和协作。
4.5 专业EV期刊的作用
Journal of Extracellular Vesicles于2012年创刊，作为ISEV旗舰期刊。Journal of Extracellular Biology于2021年成立，进一步扩大EV研究的传播平台。
5 EV生物学技术进步的历史
5.1 成像技术：观察不可见之物
最早通过电子显微镜（EM）获得了血小板来源颗粒、基质囊泡和多泡体腔内囊泡的可视证据。
5.2 分离方法与EV生物学的崛起
差速超速离心法的广泛应用使得EV富集成为可能，为发现EV递送功能性RNA提供了条件。
5.3 分子谱分析与货物发现
基于质谱的蛋白质组学分析显示EV货物反映来源细胞的生理状态，支持其作为生物标志物和信号调节因子的应用。
5.4 单颗粒方法与EV异质性
纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）可定量评估颗粒浓度和尺寸分布；高灵敏度流式细胞术可进行表型表征；微流控技术支持从复杂生物流体中提取稀有囊泡亚群。
5.5 技术作为生物学发现的媒介
不同分离和表征方法显著影响EV的纯度、组成和功能特性，因此要求严格的标准化和方法学报告，这正是MISEV指南的核心原则。
6 EV作为治疗载体的未来
6.1 EV作为生物治疗剂
EV可作为无细胞生物制剂，传递复杂的分子货物，参与组织修复、炎症调控和再生。已有临床前研究评估EV治疗呼吸系统疾病（如COVID-19和急性呼吸窘迫综合征）的潜力。
6.2 EV作为药物递送系统
EV的纳米尺寸、膜组成和与多种细胞群相互作用的能力使其成为递送小分子、核酸和蛋白质的有吸引力的系统，尤其可穿越生物屏障，用于神经系统疾病和肿瘤治疗。
6.3 临床转化：机遇与挑战
监管标准化、批次一致性、产品异质性和制造可扩展性仍是临床转化的主要障碍。需要建立可重复的分析系统、标准释放标准和验证效力检测方法。
6.4 制造、质量控制与监管考虑
未来的EV工程、生物加工和表征方法进步有望扩大治疗应用，重点在于降低异质性、改善细胞内递送和组织靶向。
6.5 EV介导精准医学的未来方向
EV研究从“血小板尘埃”到工程化纳米治疗剂的演变，体现了生物学、技术和协作标准化的融合如何使被忽视的细胞现象转变为现代医学的前沿。
7 结论
EV研究的历史展示了科学范式如何通过观察、技术创新和协作探究而演化。EV从血浆中不明颗粒物质转变为细胞间通讯的关键介质。过去六十年中，先驱研究奠定了EV生成、货物转移和功能信号的基础，而分析工具和标准化框架推动了该学科的成熟。当前，EV不仅是生理和病理过程的基本介质，也是诊断和治疗应用的潜在平台。为成功转化，必须克服制造标准化、GMP合规、效力评估和质量控制等挑战，并加强行业、监管机构、临床医生和研究人员之间的合作。随着这些障碍的逐步解决，EV有望成为下一代精准医学的关键组成部分。
