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规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)–Cas9筛选已成为功能基因组学的核心技术，通过混合扰动实现全基因组规模的基因功能解析。早期CRISPR筛选采用生存或简单表型读数来鉴定必需基因和耐药机制。然而，随着生物学问题转向理解调控网络、细胞异质性和环境依赖性基
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)–Cas9筛选已成为功能基因组学的核心技术，通过混合扰动实现全基因组规模的基因功能解析。早期CRISPR筛选采用生存或简单表型读数来鉴定必需基因和耐药机制。然而，随着生物学问题转向理解调控网络、细胞异质性和环境依赖性基因功能，对能够捕获超越细胞适应度的复杂细胞表型的筛选策略的需求日益增加。近年来，单细胞测序、高内涵成像和空间转录组学的进展通过实现遗传扰动后的多维度表型表征，扩展了CRISPR筛选的分辨率。通过将混合扰动与多样化读数整合，这些方法系统地绘制了靶向基因编辑与转录状态、细胞表型和微环境背景之间的关联。同时，文库设计、递送和计算流程的创新进一步提升了高内涵筛选平台的稳健性和可解释性。本综述综合了CRISPR筛选的方法学演进，重点阐述了扰动策略、递送系统和多模态读数的进展。文中详述了涵盖肿瘤学、免疫治疗、发育生物学、神经生物学和感染性疾病的代表性应用，以展示精细化的基因网络注释。此外，还对现有的技术瓶颈，如可扩展性、成本限制和体内应用的局限性进行了批判性评估。最后，提出了促进精准医学发展的未来方向。
2 高内涵CRISPR筛选的方法学
高内涵CRISPR筛选的成功实施需要多个技术模块的无缝整合。本节系统性地概述了这些核心组成部分，从扰动模式的选择和文库设计开始，随后评估和比较病毒与非病毒递送系统，重点关注其工作原理、技术优势、关键局限性和适用场景。接着讨论了这些工具在不同体外和体内疾病模型中的应用，最后回顾了前沿的高内涵读数平台，这些平台使该方法区别于传统工具如RNA干扰(RNAi)。
2.1 CRISPR扰动模式与文库设计
尽管高内涵筛选产生多样化的表型读数，但其方法的核心在于扰动模式的多样化和其文库的审慎设计。对于不同的CRISPR扰动模式，如CRISPR敲除(CRISPRko)、CRISPR干扰(CRISPRi)、CRISPR激活(CRISPRa)，需要设计与各自方法兼容且具有特定靶向规则的引导RNA(gRNA)文库。研究人员可以根据特定的生物学问题选择不同的文库，大致分为全基因组文库和靶向文库。
2.1.1 CRISPR敲除(CRISPRko)
CRISPR–Cas9技术通过大规模功能缺失(LOF)筛选革新了基因型与表型的分布。CRISPRko作为一种基础模式，依赖野生型Cas9蛋白在gRNA引导下于靶位点诱导DNA双链断裂(DSBs)。随后通过易错的非同源末端连接(NHEJ)修复机制引入移码突变，从而实现永久的基因失活。CRISPRko的最大优势在于其基因敲除的永久性和彻底性，适用于研究基因的长期效应。然而，其局限性也正源于此：它不适合研究基因功能的急性、可逆效应。此外，NHEJ在非分裂或分裂不活跃的细胞（如神经元、心肌细胞和终末分化细胞等）中效率低下，使得CRISPRko不适用于这些非分裂细胞。CRISPRko筛选还必须考虑脱靶效应的影响，即由gRNA引导的Cas9在非靶向基因组位点引发的意外切割，这可能引入假阳性或假阴性信号。这一问题可通过优化gRNA设计和采用高保真度Cas9变体等策略来缓解。
2.1.2 CRISPR干扰(CRISPRi)
CRISPRi利用催化失活的Cas9(dCas9)在不切割DNA双链的情况下抑制转录，从而沉默靶基因。因此，CRISPRi在功能上也归类为LOF筛选。在CRISPRi筛选中，一旦移除dCas9，基因功能可以恢复。这种可逆性使其适用于功能恢复实验或基因功能动态变化的研究。由于不诱导DSBs，与CRISPRko相比，CRISPRi具有更高的安全性和更低的脱靶效应。CRISPRi的低细胞毒性和高安全性使其广泛应用于涉及非致死细胞表型的研究，包括代谢、线粒体功能和免疫信号通路。然而，CRISPRi介导的基因沉默对gRNA的选择更为敏感，并且与使用活性Cas9相比，通常导致不完全的沉默。为解决此问题，研究人员改进了dCas9和Krüppel相关框(KRAB)结构域，已部分缓解了这一难题。此外，Stadager等人开发了一种名为CRISPRgenee的创新基因编辑系统，该系统通过双sgRNA载体设计首次将CRISPRko和CRISPRi技术整合到单一系统中，从而在不增加基因毒性应激的情况下提高LOF率，促进了用于高级LOF筛选的文库规模缩减。
2.1.3 CRISPR激活(CRISPRa)
CRISPRa是一种功能获得(GOF)筛选方法，通过将dCas9与各种转录激活因子结合，从而提高靶基因的表达水平。第一代CRISPRa系统，命名为dCas9–VP64，是通过将四个单纯疱疹病毒来源的VP16转录激活结构域融合到dCas9的C末端构建而成。这种配置在激活内源基因表达方面通常表现出低至中等的效率。为提高基因转录激活的效率，Konermann等人开发了CRISPR协同激活中介体(SAM)系统。在该系统中，一个MS2发夹适配体被附加到sgRNA上，进而招募MS2–p65–HSF1融合蛋白。这三个不同激活结构域的联合作用协同放大了转录激活效率。基于协同激活的原理，进一步的创新集中在实现更高效率和更紧凑的系统架构上。CRISPR VP64–p65–Rta(VPR)通过用融合了VP64、p65和Rta三个激活结构域的改进型转录调节因子替换VP64，显著增强了基因激活水平。SunTag蛋白质招募系统也被用于优化CRISPRa。在此方法中，多个拷贝的短表位肽GCN4被融合到dCas9上，而转录激活因子VP64则融合到其同源单链可变区(scFv)抗体上。这种设计使得GCN4–dCas9融合蛋白能够高效招募多个scFv–VP64拷贝，从而放大靶基因的表达。与传统的过表达技术相比，CRISPRa通过激活内源启动子有效驱动基因表达，从而无需构建外源表达元件，并克服了转录本大小的限制。dCas9介导的基因调控是可逆的，不会引起基因组DNA的永久性改变。它还能实现对多个靶基因的同时调控。此外，通过将dCas9与荧光蛋白融合，可以可视化追踪靶基因的定位。然而，CRISPRa的广泛应用受到其组件尺寸过大和潜在免疫原性的制约，需要优化的递送策略以实现稳健且安全的表达。此外，与所有其他CRISPR–Cas系统一样，存在靶细胞对细菌Cas蛋白产生免疫反应的风险。
2.1.4 碱基编辑(Base Editing)与先导编辑(Prime Editing)
碱基编辑器是将催化受损的Cas核酸酶与脱氨酶结合的工程化融合蛋白。它们不产生DSBs，而是直接在DNA链上催化特定核碱基的化学转化。迄今为止，已开发出两类主要的碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，可实现C•G碱基对向T•A的转换；以及腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，可促进A•T向G•C的转换。由于不依赖DSBs和易错的NHEJ修复途径，产生随机插入/缺失(indels)的概率极低。此外，碱基编辑器中与DSBs相关的不良事件也更少。在对更高通用性和精度的追求驱动下，先导编辑作为一项“搜索和替换”技术被开发出来。先导编辑是一种多功能且精确的基因组编辑方法，可直接将新的遗传信息写入指定的DNA位点。这是通过使用一种由Cas9切口酶和逆转录酶组成的工程化融合蛋白来实现的，该蛋白由先导编辑指导RNA(pegRNA)编程。pegRNA既指定了靶基因组位点，也编码了所需的编辑。Jesse M. Engreitz领导的团队开发并系统验证了一个名为“Variant-EFFECTS”的高内涵平台。该创新平台将CRISPR先导编辑与基于流式的RNA荧光原位杂交或荧光抗体检测相结合，能够在内源基因组背景下同时引入数百种设计的DNA序列编辑并定量测量其对靶基因表达的精确影响。碱基编辑作为一种精确的基因编辑工具，在遗传病治疗领域显示出巨大潜力，包括杜氏肌营养不良症、遗传性视网膜疾病、遗传性听力损失、血液遗传性疾病、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、扩张型心肌病、CD3δ严重联合免疫缺陷和脊髓性肌萎缩症。然而，碱基编辑仍面临效率低、需要优化递送方法以及对长期安全性和相关临床风险的担忧等挑战。
2.1.5 CRISPR筛选文库设计
基于上述CRISPR扰动模式的不同特点，将其转化为实用筛选工具的关键在于gRNA文库的靶向设计。根据研究目标，gRNA文库通常根据筛选范围和设计灵活性分为三类。全基因组文库，如广泛使用的Brunello文库，能够在整个基因组范围内进行系统性、无偏见的基因功能发现，但需要大量的细胞数和深度测序覆盖度，因此成本高昂且资源密集。相比之下，靶向文库专注于预定义的基因集，以研究与特定生物学问题相关的基因。此外，定制设计文库用于复杂的生物学场景，允许研究人员针对高度特异和个性化的科学问题自由设计和构建gRNA文库，从而满足超出标准商业文库范围的筛选目标。除了文库类型的选择之外，几个通用的设计原则对筛选成功至关重要。这些原则包括采用稳健的算法来选择具有高活性且最小脱靶效应的sgRNA。文库的覆盖深度和复杂性对于维持统计功效至关重要。文库应包含足够数量的gRNA，以确保在整个实验中每个gRNA在感染的细胞中保持足够的初始覆盖深度。CRISPR文库的递送必须严格控制，因为此步骤的目标是实现文库高效且均一地导入靶细胞群体。递送的一个关键方面是精确确定最佳感染复数(MOI)，以确保大多数细胞只整合一个gRNA。这对于防止混淆遗传条形码与所得表型结果之间的关系至关重要。
2.2 CRISPR筛选的文库递送系统
CRISPR/Cas系统在基因编辑和筛选中的应用依赖于将CRISPR组分（Cas蛋白和gRNA）有效递送到靶细胞中。递送系统的选择是设计CRISPR筛选实验时的关键考量因素，因为它直接影响编辑效率、安全性和在不同模型中的适用性。本文回顾了最广泛使用的CRISPR/Cas9递送系统，大致可分为两类：病毒载体递送和非病毒递送方法。
2.2.1 病毒载体递送
病毒载体因其固有的感染性和高效的基因转导能力，在CRISPR递送中占有重要地位。常用的病毒载体包括慢病毒(LVs)和腺相关病毒(AAVs)。慢病毒载体是基于HIV-1病毒改造的载体系统。其包装容量约为8 kb。LVs直径约100 nm，通常由几个基本组件构成，包括5′长末端重复序列(LTR)、Ψ包装信号、中心多嘌呤束/终止序列、Rev响应元件和含有poly(A)信号的3′ LTR。LVs是混合CRISPR筛选的主要递送载体。它们能实现遗传扰动的稳定基因组整合，确保所需基因在细胞分裂过程中持续表达而不丢失。此外，LVs在分裂和非分裂细胞中都表现出高转导效率。为了应对难转导悬浮细胞的挑战，Napoleone等人开发了一种基于LVs的两步静态转导方案。该方法提高了悬浮适应的中国仓鼠卵巢-K1和人胚肾293-6E细胞的转导效率。LVs主要适用于体外基因编辑，特别是大规模的功能基因组筛选，以研究基因功能、药物靶点和疾病机制。以CROP-seq为例，该技术将hU6-gRNA构建体整合到LVs的3′ LTR区域，利用病毒整合使其能与宿主基因组共转录。由于gRNA嵌入在多聚腺苷酸化的mRNA转录本中，其序列可以通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)直接检测，无需额外条形码化即可建立遗传扰动与单细胞表型之间的直接联系，从而显著提高了筛选的准确性和通量。尽管有这些优势，LVs也存在一些缺点，主要表现为插入诱变的风险。LVs随机地将携带的sgRNA整合到宿主基因组中，这一过程可能破坏抑癌基因、激活癌基因或干扰内源性调控元件（如启动子和增强子），从而引入与靶基因破坏无关的表型伪影。LV的颗粒成分和污染物可能引发免疫反应。这种非特异性免疫激活会严重干扰对诸如肿瘤微环境(TME)等生理过程的准确评估，导致筛选结果出现偏差。虽然慢病毒载体的包装容量（通常为8-10 kb）通常足以容纳标准的CRISPRko构建体，但对于递送更大的载荷，如体积更大的Cas变体或更复杂的调控元件，常常显得不足。
AAVs是由直径约26 nm的二十面体蛋白质衣壳和约4.7 kb的单链DNA基因组组成的无包膜单链DNA病毒，其基因组可以是正义链或反义链。与LVs相比，其最显著的优势在于免疫原性极低和安全性良好，这使其更适合于体内CRISPR筛选应用。利用这些优势，近期研究已成功实施了基于AAV的高内涵筛选，以剖析体内的复杂生物过程。Zheng等人利用大规模并行AAV介导的体内Perturb-seq绘制了组织发育过程中的细胞类型特异性转录网络，展示了AAVs捕捉活生物体中动态基因调控变化的能力。Santinha等人应用AAV介导的直接体内单细胞CRISPR筛选(AAV-Perturb-seq)，利用基因编辑和转录抑制系统性地剖析了成年小鼠大脑前额叶皮层中22q11.2缺失综合征基因的表型景观。Peng等人通过在实体瘤小鼠模型中使用体内AAV–睡美人(Sleeping Beauty)–CRISPR筛选，对肿瘤浸润的自然杀伤细胞进行了无偏见的功 能图谱分析，以鉴定嵌合抗原受体(CAR-NK)疗法的遗传检查点。Kampmann团队开发了一种名为CrAAVe-seq的新型体内筛选平台，该平台使用AAV递送的Cre依赖性sgRNA文库结合附加体测序，实现了在小鼠大脑特定细胞类型中进行高内涵、低成本和高灵敏度的CRISPRi筛选。这些应用凸显了AAVs作为在完整生物体中进行高内涵表型分析的强大且多功能工具的地位。然而，AAVs在CRISPR筛选中的应用受到其有限包装容量（小于5.2 kb）的限制，这常常需要使用双载体系统和Cas变体，从而增加了实验复杂性并可能限制靶向范围。由于其主要以附加体形式存在而不整合到宿主基因组中，AAV递送的转基因表达在快速分裂的细胞中会随着增殖迅速稀释。这一固有局限性使得AAVs从根本上不适用于常规的、基于长期增殖的体外混合筛选，因此更适合应用于非分裂细胞或短期表型筛选。
2.2.2 非病毒载体递送
尽管病毒载体在筛选应用中广泛使用，但其复杂的生产过程、潜在的免疫原性和有限的载荷能力限制了它们在高内涵筛选中的应用。非病毒递送方法因其高安全性和低免疫原性，已成为LVs和AAVs等病毒载体的重要补充或替代方案。核糖核蛋白(RNP)递送是主要的非病毒递送方法，指将Cas9蛋白与gRNA在体外组装成RNP复合物后直接导入细胞。与依赖宿主细胞转录和翻译机制的DNA载体不同，RNP复合物进入细胞后立即表现出核酸酶活性，无需预先表达，从而实现快速精确的基因敲除。RNP复合物的功能持续时间非常短暂。完成编辑过程后，它会被细胞蛋白酶迅速降解，体现了一种独特的“快启快停”操作策略。RNP递送已广泛应用于高内涵CRISPR筛选。例如，Hultquist等人建立的高内涵RNP筛选平台能够在原代T细胞中系统性地剖析HIV宿主依赖因子。Meier等人将RNP转染到诱导多能干细胞(iPSC)衍生的髓系细胞中，确定了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号通路是APOE3和APOE敲除小胶质细胞中脂质储存的关键调节因子。Chen等人开发的CRISPR-READI技术，利用Cas9/sgRNA RNP电穿孔与AAV供体感染的协同作用，建立了一个高效、高通量、无需显微注射的小鼠精密基因组工程平台，并有望扩展到其他哺乳动物物种。尽管RNP递送在阵列式筛选中具有显著优势，但其局限性也不容忽视。RNP复合物的快速细胞内降解可能限制其在需要持续表型观察的研究中的应用。此外，RNP组分的生产或采购成本高昂，且易受有毒物质污染。RNP递送依赖电穿孔，这会诱导细胞毒性和细胞应激，可能干扰高内涵筛选中敏感的表型读数。这种物理方法也基本上局限于体外环境。为了解决这些局限性，脂质纳米颗粒(LNP)已成为一种多功能的非病毒递送系统。
LNP是目前临床上最成功的非病毒核酸递送系统，具有四种主要成分：可电离阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)脂质、两性离子磷脂和胆固醇。可电离阳离子脂质带有正电荷的头基，可通过静电相互作用包裹核酸。PEG脂质的疏水尾部插入LNP的脂质层，在表面形成亲水性空间屏障以防止聚集。磷脂和胆固醇被视为提供稳定性的辅助脂质，它们相互作用以维持脂质双层的有序相，从而保持其完整性。与RNP类似，LNP也表现出良好的生物安全性，具有低脱靶效应和非整合特性。然而，与受电穿孔诱导细胞毒性限制的RNP不同，LNP对细胞更安全、更温和。由于其耐受性好，并通过内吞过程进入细胞，它能保持细胞健康，是高内涵研究的理想递送载体。Rouatbi等人开发了一种能够高效共递送Cas9 mRNA和gRNA的LNP平台，并在原位间充质胶质母细胞瘤癌症干细胞模型中实现了体内基因编辑，证明了LNP作为体内递送载体的潜力。值得注意的是，Chen等人开发了一种利用LNP封装和递送RNP的递送平台，提高了编辑效率，同时整合了两种递送方法的优点。虽然LNPs通过利用更温和的内吞途径克服了依赖电穿孔的RNP递送所带来的细胞毒性，但它们面临着与RNP作为非病毒载体相似的挑战。LNP基因编辑不会整合到基因组中，无法像慢病毒载体那样实现稳定的遗传。因此，编辑效果或外源物质会随着细胞分裂迅速稀释。这使得LNP难以应用于需要长期追踪表型变化或以细胞增殖为读数的CRISPR筛选。此外，LNP的可电离脂质成分可能引发免疫反应，激活多种炎症通路并诱导白细胞介素(IL)-1β和IL-6。而且，LNP的生产工艺更复杂，生产成本也更高。
除了传统的RNP和LNP，新一代刺激响应性聚合物递送载体已被设计用于实现时空可控的递送，在高内涵CRISPR筛选中具有潜在用途。微流控细胞变形是一种新兴的物理递送技术，通过诱导细胞膜的瞬时变形促进大分子高效进入细胞内，在CRISPR筛选中展现出应用前景。细胞穿透肽(CPPs)是短的、能跨膜的肽段，能够通过非共价复合作用将大分子货物（如RNP）递送入细胞，为传统载体系统提供了一种瞬时的、低毒性的非病毒替代方案。外泌体大小约40至150 nm，是大多数细胞类型分泌的源自内体的细胞外囊泡。它们能够携带和转移包括质粒、蛋白质、小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)在内的多种生物分子至受体细胞，已成为递送CRISPR/Cas9组分的高效载体，有望克服病毒和其他非病毒递送载体的主要局限性。Xiong等人开发了一种基于重组酶的方法，利用Bxb1重组酶介导的盒式交换作为递送载体，实现了无病毒的、全基因组范围的CRISPRko筛选。
总之，递送系统是高内涵CRISPR筛选设计和成功的关键决定因素。主要递送系统如图2和表1所示。虽然病毒载体在稳定的、长期的体内应用中仍然不可或缺，但非病毒的RNP和LNP平台提供了更安全、更短暂的替代方案，要求研究人员根据其筛选模型的具体时间需求，仔细权衡递送效率和整合风险。
