《Nature Chemical Biology》：Chemogenomic maps reveal a PRDX1-dependent iron–damage axis in the DNA damage response
编辑推荐：
DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）是一个复杂的细胞通路网络，其扰动会导致基因组不稳定，并且是肿瘤发生的关键标志。研究人员展示了来自32个全基因组规模功能缺失型CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi
DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）是一个复杂的细胞通路网络，其扰动会导致基因组不稳定，并且是肿瘤发生的关键标志。研究人员展示了来自32个全基因组规模功能缺失型CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）化学-遗传筛选的数据，这些筛选使用靶向DDR核心组分（PARP、ATR、ATM、DNAPK和WEE1）的抑制剂，既作为单药，也作为与聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂（poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor，PARPi）的联合用药。这些实验鉴定出超过1000个其扰动可改变DDR的基因，为DDR研究领域提供了丰富的资源。此外，这一功能基因组学数据汇编揭示了调控DDR的关键原理，并强调了过氧化物氧化还原蛋白PRDX1活性缺失与所有测试的DDR抑制剂之间通过涉及MRGBP–PAX7–IREB2轴介导的铁可用性机制产生的强化学-遗传相互作用。研究数据将PRDX1定位为DNA损伤积累的关键抑制因子，并成为与DDR抑制剂联合使用的潜在可成药靶点。
**论文解读：化学基因组图谱揭示PRDX1依赖性铁损伤轴在DNA损伤应答中的核心作用**
**一、研究背景与科学问题**
DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）是生物体维持基因组完整性的核心网络体系，负责感知DNA损伤、启动修复代谢并协调细胞周期进程。DDR通路的功能紊乱会导致基因组不稳定，进而促进肿瘤的发生与演进。在肿瘤细胞中，DDR基因的突变虽然驱动了基因组不稳定性和肿瘤恶性表型的获得，但也为选择性杀伤肿瘤细胞提供了治疗窗口。基于这一原理，靶向DDR关键激酶的小分子抑制剂，如PARP抑制剂（PARPi）、ATR抑制剂（ATRi）、ATM抑制剂（ATMi）、DNAPK抑制剂（DNAPKi）和WEE1抑制剂（WEE1i）等已在临床前和临床研究中展现出重要价值。然而，DDR通路的复杂性、各组分间的交叉调控以及肿瘤细胞对DDR抑制剂（DDRi）的内在耐药机制仍远未阐明。因此，系统绘制DDRi作用的全基因组遗传修饰图谱，深入理解DDR调控网络和耐药机制，对于优化基于DDRi的肿瘤治疗策略具有重要意义。该研究发表在《Nature Chemical Biology》。
**二、研究内容概述**
研究人员利用A549非小细胞肺癌细胞系，开展了32个全基因组规模的功能缺失型CRISPR干扰（CRISPRi）化学-遗传筛选，系统解析了细胞对五种核心DDR抑制剂（PARPi、ATRi、ATMi、DNAPKi和WEE1i）及其与PARPi联合用药的遗传决定因素。通过综合网络分析，研究人员发现过氧化物氧化还原酶PRDX1是跨越所有DDRi条件的通用敏感化基因。进一步的表位遗传筛选和机制研究表明，PRDX1通过MRGBP–PAX7–IREB2轴调控细胞内铁稳态，抑制铁介导的氧化性DNA损伤。
**三、主要技术方法**
该研究运用了以下关键技术：（1）全基因组CRISPRi功能筛选：使用靶向约19，000个蛋白编码基因转录起始位点的单导向RNA（sgRNA）文库和双导向sgRNA文库，在A549细胞中开展单药和联合用药筛选；（2）混合群体生长竞争实验：通过流式细胞术追踪sgRNA阳性与阴性细胞的比例变化，以耐药指数（resistance index，RI）量化基因扰动对DDRi敏感性的影响；（3）RNA测序（RNA-seq）转录组分析：鉴定MRGBP、PAX7和IREB2之间的表达调控关系；（4）FerroOrange荧光探针检测细胞内不稳定铁池水平；（5）γH2AX流式细胞术和免疫荧光显微镜检测DNA损伤水平；（6）构建线粒体靶向D-氨基酸氧化酶（mito–DAO）细胞系，通过D-丙氨酸补充实现线粒体H?O?的持续产生，用于验证铁介导的Fenton化学在DNA损伤中的作用。样本来源包括A549、H1703、H2030等肺癌细胞系。
**四、研究结果**
**（1）CRISPRi筛选揭示DDR原理**
研究团队在A549细胞中建立了dCas9–KRAB CRISPRi系统，分别针对PARPi、ATRi、ATMi、DNAPKi和WEE1i开展了全基因组筛选，并进行了PARPi联合筛选。结果表明，筛选数据具有良好的重复性和可靠性，鉴定出超过1，200个敏感化基因和300余个耐药基因，包括RNASEH2B/RNASEH2C、BRCA1等已知DDR相关因子。基因本体论（GO）富集分析显示，敏感化基因富集于DNA复制、损伤检查点、重组修复等经典DNA修复通路。通过图论网络分析，研究发现PRDX1、CDK12、MCPH1、RAD9A、RFC5和XRCC3六个基因在所有筛选条件下均为显著耗竭的通用敏感化基因。
**（2）PRDX1缺失使细胞对多种DDRi敏感**
验证实验证实，敲低PRDX1可显著增强A549细胞对PARPi、ATRi、ATMi和DNAPKi的敏感性，而对功能机制不相关的MEK抑制剂和多西他赛无此效应。在PRDX1敲除细胞中联合DNAPKi处理，可协同增加γH2AX核灶的形成和整体水平，而回补PRDX1 cDNA可大部分逆转这一表型，表明PRDX1缺失通过促进DNA损伤积累来驱动DDRi敏感性。
**（3）胞质过氧化物氧化还原酶活性选择性促进DDRi耐药**
在PRDX1敲除细胞中分别回补PRDX1–PRDX6家族成员的cDNA，发现PRDX1和PRDX2均能恢复细胞对DNAPKi的抗性，而PRDX3–PRDX6无效。亚细胞定位实验表明，将PRDX3和PRDX4从线粒体或内质网重新定位至胞质后，同样可以恢复DNAPKi抗性。此外，一系列蛋白或小分子抗氧化剂（包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、铁死亡抑制剂ferrostatin-1和Trolox及N-乙酰半胱氨酸等）均无法挽救PRDX1缺失导致的DNAPKi敏感性，提示PRDX1的作用可能依赖于对特定亚细胞区域活性氧（ROS）池的精准清除。
**（4）PRDX1表位遗传筛选揭示氧化性DNA损伤调控因子**
在A549野生型和PRDX1敲除细胞中开展的双导向sgRNA文库筛选显示，PRDX1缺失与DDR通路多个核心组分的敲低存在强遗传互作，尤其是PARP1。在PRDX1敲除背景中，IREB2、PAX7、MRGBP和WRAP53的敲低能够赋予细胞对DNAPKi的抗性，其中IREB2、MRGBP和PAX7敲低可抑制DNAPKi诱导的γH2AX水平升高。进一步验证表明，IREB2敲低也能在其他DDRi处理条件下赋予PRDX1敲除细胞一定程度的抗性。
**（5）PRDX1抑制铁介导的DNA损伤**
RNA-seq分析揭示MRGBP和PAX7共同正向调控IREB2的表达。FerroOrange探针检测显示，敲低IREB2、MRGBP或PAX7均可降低细胞内游离铁水平。在PRDX1敲低细胞中，铁螯合剂地拉罗司（DFO）部分恢复了DNAPKi抗性，而补充柠檬酸铁铵（FAC）则加剧了敏感性。利用mito–DAO系统在PRDX1敲除细胞中诱导H?O?产生并结合DNAPKi处理，IREB2敲低可显著降低DNA损伤水平。此外，不同肺癌细胞系的铁含量与PRDX1依赖性相关：H1703细胞铁含量低且对DNAPKi敏感性较温和，而A549和H2030细胞铁含量较高且对PRDX1扰动高度敏感。
**五、讨论与结论**
该研究通过系统性的全基因组CRISPRi化学-遗传筛选，构建了DDRi单药及联合用药的全面遗传互作图谱，揭示了DDR通路的核心调控原则。研究发现PRDX1作为关键的DNA损伤抑制因子，通过MRGBP–PAX7–IREB2轴调控细胞内铁稳态，从而抑制铁依赖的氧化性DNA损伤，这一机制独立于经典的ROS清除功能。研究还发现，A549和H2030细胞均携带KEAP1突变，提示这一遗传背景可能与PRDX1依赖性相关。该研究不仅为DDR研究领域提供了可搜索的开放数据资源（https://ddri-screens.gilbertlab.arcinstitute.org），还为IREB2表达水平、PAX7和MRGBP活性以及肿瘤细胞内不稳定铁水平作为DDRi疗效预测生物标志物提供了理论依据。结论部分指出，PRDX1在保护基因组免受DNA损伤方面发挥关键作用，其机制部分通过抑制铁依赖性DNA氧化实现；IREB2表达、PAX7和MRGBP活性或肿瘤中的不稳定铁水平可能作为DDRi和PRDX1靶向治疗反应的生物标志物，PRDX1与DDRi联合使用具有重要的潜在治疗价值。
