巨噬细胞在活细胞摄取过程中将功能性蛋白质转移至其自身表面

《Nature Chemical Biology》：Macrophages transfer functional proteins to their surface during live-cell uptake

　　

细胞的蛋白质组（proteome）被认为反映了其转录和翻译活性。巨噬细胞（macrophage）通常从邻近细胞获得外源性物质，这一过程被认为会导致该物质的降解。然而，越来越多的证据表明，并非所有被摄取的物质都会被降解，其他类似转移的过程也会发生。领域标准技术无法严格报告在这些相互作用过程中巨噬细胞蛋白质组被改变的精确方式和对象，使得非降解过程对表型改变贡献的程度仍未解决。在此，研究人员利用化学工具和蛋白质组学（proteomics）表明，完整的靶癌细胞表面蛋白质以与活细胞摄取（live-cell uptake）相关的方式被转移至巨噬细胞表面，并达到具有功能影响的水平。细胞摄取过程中蛋白质的广泛获得重塑了巨噬细胞表面蛋白质组，并且是一个转录沉默的（transcriptionally silent）、细胞非自主的（cell-nonautonomous）过程，具有改变代谢摄取的潜力。

细胞蛋白质组通常被认为反映了其转录和翻译活性。巨噬细胞通过吞噬等过程摄取外源物质，经典的命运是降解。然而，越来越多的证据提示存在非降解性转移。目前标准技术无法严格追踪蛋白质的来源，因此非降解过程对巨噬细胞表型改变的程度和机制尚不清楚。在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）常表现出与邻近癌细胞相似的转录特征，但这一RNA信号是否导致巨噬细胞自身合成相应蛋白、是否通过直接获得靶细胞蛋白或mRNA而改变蛋白质组，尚未得到区分。研究人员针对这一问题开展了研究。

研究人员利用稳定同位素标记的氨基酸（stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC）与质谱（mass spectrometry, MS）联用，结合表面生物素化（biotinylation）、流式细胞术（flow cytometry）、成像流式（ImageStream）、共聚焦显微镜等技术，并采用细胞松弛素D（cytochalasin D）、transwell小室、calpain抑制剂等处理，以及CRISPR–Cas9基因敲除和代谢探针，系统研究了巨噬细胞与癌细胞共培养过程中蛋白质的转移现象。研究使用了来自小鼠4T1乳腺癌模型和原代人实体瘤切除标本的巨噬细胞，以及人原代单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophage, MDM）与SW620、Raji等癌细胞系共培养的体外体系。研究发现，靶癌细胞表面蛋白可以完整地转移至巨噬细胞表面，且该过程依赖于细胞间接触和肌动蛋白聚合，与活细胞摄取密切相关。转移的蛋白数量庞大，能够重塑巨噬细胞表面蛋白质组。进一步证实，转移的葡萄糖转运蛋白GLUT1（SLC2A1）和谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5具有功能，能够增加巨噬细胞对相应底物的摄取。该研究揭示了活细胞摄取过程中蛋白质直接转移并功能性再部署（functional redeployment）的现象，为理解肿瘤微环境中巨噬细胞的功能重塑提供了新机制，论文发表在《Nature Chemical Biology》。

### 体内巨噬细胞表面可检测到一种癌细胞表面蛋白

通过分析4T1小鼠乳腺癌模型的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，研究人员注意到一部分TAMs表达上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）的转录本。流式细胞术进一步证实，从4T1肿瘤中分离的TAMs表面存在EpCAM，而骨髓来源巨噬细胞（bone-marrow-derived macrophage, BMDM）则为阴性。利用表达GFP的4T1细胞，研究人员发现GFP⁺（即已摄取癌细胞内容物）的TAMs具有更高的EpCAM表面染色。对EpCAM⁺和EpCAM^? TAMs进行质谱分析，发现EpCAM⁺ TAMs富集了更多4T1细胞特异性蛋白，这些蛋白中多数定位于胞内区室。在原代人肿瘤标本中，TAMs（CD11b⁺CD14⁺）也检测到表面EpCAM，而外周血单核细胞和MDMs均为阴性。这些结果表明，肿瘤微环境中摄取癌细胞的巨噬细胞表面存在完整的癌细胞蛋白。

### 化学蛋白质组学确定蛋白质的细胞来源

为了区分巨噬细胞表面新出现的蛋白究竟来自自身合成、mRNA转移后翻译还是直接蛋白转移，研究人员建立了巨噬细胞与重同位素标记的SW620结肠癌细胞共培养体系，并利用钙黄绿素（calcein）标记区分高摄取（calcein^hi）和未摄取（calcein^?）的巨噬细胞。质谱分析显示，calcein^hi巨噬细胞同时含有轻（巨噬细胞合成）和重（癌细胞合成）蛋白，而calcein^?巨噬细胞几乎只含轻蛋白。比较轻蛋白组时，两种巨噬细胞无明显差异，说明巨噬细胞自身蛋白质合成并未显著改变；而重蛋白组中，超过3,100种蛋白在calcein^hi巨噬细胞中富集。RNA测序也显示calcein^hi巨噬细胞呈现巨噬细胞与癌细胞的中间转录特征，且可检测到EPCAM转录本。表面蛋白组分析进一步表明，巨噬细胞来源的轻蛋白在两种细胞间基本不变，而来自癌细胞的约300种重蛋白在calcein^hi巨噬细胞表面显著富集，包括EpCAM。这些数据证明，活细胞摄取使大量完整癌细胞蛋白转移至巨噬细胞表面。

### 细胞摄取后巨噬细胞表面可检测到EpCAM

通过流式细胞术，研究人员确认共培养后EpCAM⁺calcein⁺巨噬细胞群的抗EpCAM染色最强，而EpCAM⁺calcein^?群体染色较弱。利用pH敏感的pHrodo绿色染料，成像流式显示，含有已进入溶酶体的癌细胞内容物（pHrodo⁺）的巨噬细胞表面可检测到EpCAM。共聚焦显微镜进一步证实，吞噬了CellTracker Green标记的SW620细胞的巨噬细胞表面存在EpCAM斑片，而对照巨噬细胞无此信号。这些结果在单细胞水平明确了EpCAM定位于参与活细胞摄取的巨噬细胞表面。

### 细胞间接触是EpCAM转移所必需的

用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D处理共培养体系后，EpCAM⁺calcein⁺巨噬细胞群几乎消失，而EpCAM⁺calcein^?群体不受显著影响。将癌细胞裂解液或条件培养基加入巨噬细胞，未产生EpCAM⁺或calcein⁺群体；用calpain抑制剂calpeptin抑制囊泡脱落也不改变EpCAM阳性率或平均荧光强度。在transwell体系中，巨噬细胞与癌细胞物理分离后，未观察到calcein⁺或EpCAM⁺巨噬细胞。这些结果表明，EpCAM转移需要直接的细胞–细胞接触和肌动蛋白依赖的摄取过程，而非外泌体或游离蛋白介导。

### 转移的蛋白曾定位于细胞表面

为验证转移蛋白是否原本就位于靶细胞表面，研究人员用不可通透的生物素标记靶细胞表面蛋白，再与巨噬细胞共培养。结果显示，calcein⁺巨噬细胞表面有高水平的生物素信号，且几乎所有calcein⁺巨噬细胞均为生物素阳性；calcein^?巨噬细胞也有较弱信号。细胞松弛素D处理消除了calcein⁺群体，而calcein^?上的生物素信号仅轻度降低。用生物素化癌细胞裂解液处理则无生物素阳性巨噬细胞出现。此外，在反向方向上也检测到少量巨噬细胞来源蛋白出现在共培养的癌细胞表面，提示低水平双向转移存在。这些结果证明，转移至巨噬细胞表面的蛋白确曾为靶细胞表面驻留蛋白。

### 再部署的转运蛋白在巨噬细胞上具有功能

质谱数据鉴定出包括葡萄糖转运蛋白GLUT1和谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5在内的多种代谢转运蛋白在calcein^hi巨噬细胞表面富集。抗体染色证实GLUT1和SLC1A5在CTG^hi巨噬细胞（即摄取癌细胞者）上高表达。使用荧光葡萄糖探针GluRho，研究人员观察到CTG^hi巨噬细胞对葡萄糖的摄取高于CTG^?巨噬细胞，且该差异依赖于温度（4°C时消失）。利用CRISPR–Cas9生成SLC1A5敲除（KO）的SW620细胞后，CTG^hi巨噬细胞表面不再检测到SLC1A5。使用非天然氨基酸同型炔丙基甘氨酸（homopropargylglycine, HPG）作为SLC1A5底物，发现CTG^hi巨噬细胞对HPG的摄取显著增加，且依赖于靶细胞SLC1A5表达，并受温度、谷氨酰胺浓度调节。这些结果表明，转移至巨噬细胞表面的转运蛋白具有功能活性，能够改变巨噬细胞的代谢摄取能力。

在讨论中，研究人员指出，靶细胞表面蛋白的转移在活细胞摄取过程中最为显著，这一过程需要持续的细胞–细胞接触和肌动蛋白重排，而其他摄取途径如胞啃（trogocytosis）、胞葬（efferocytosis）也可能参与。研究还警示，在吞噬细胞中检测到mRNA并不能证明该细胞合成了相应蛋白，因此在利用谱系标志物或转录特征进行细胞分类时需谨慎。研究人员认为，广泛、直接的癌细胞表面蛋白获得可能触发肿瘤微环境中已报道的巨噬细胞代谢转变。该现象可能也存在于非恶性环境中，为吞噬细胞在不进行基因转录或蛋白质合成的情况下快速改变自身功能提供了一种转录沉默的细胞非自主调控方式。研究结论是：蛋白质转移和功能性再部署是活细胞摄取事件中一种转录沉默的、细胞非自主的调节节点，能够重塑巨噬细胞表面蛋白质组并改变其代谢功能。