《Cell Biochemistry and Function》：Dual miRNA-Mediated Axes Act in Concert in the Antioxidant Action of Eicosapentaenoic Acid: let-7c-3p/TFAM Drives Mitochondrial Biogenesis While miR-34c-5p/SIRT1 Potentiates Enzymatic Defenses
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此前的转录组学分析显示，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）可改变HepG2细胞中的microRNA（miRNA）表达。研究人员鉴定了介导EPA抗氧化作用的两个关键miRNA-mRNA轴。研究发现，EPA下调let-7c-3p，
此前的转录组学分析显示，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）可改变HepG2细胞中的microRNA（miRNA）表达。研究人员鉴定了介导EPA抗氧化作用的两个关键miRNA-mRNA轴。研究发现，EPA下调let-7c-3p，后者直接靶向线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）。抑制let-7c-3p或过表达TFAM可增强细胞抗氧化能力、减少活性氧（reactive oxygen species, ROS）、改善线粒体功能并促进线粒体生物发生。与此同时，EPA上调miR-34c-5p，后者直接靶向NAD依赖性蛋白去乙酰化酶Sirtuin（SIRT1）。SIRT1受到抑制与抗氧化酶活性的升高相关，这些酶包括过氧化氢酶（catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）。这些发现表明，EPA通过一种双miRNA机制，协调增强线粒体生物发生与酶促防御，从而减轻氧化应激。
该论文发表于《Cell Biochemistry and Function》。研究背景方面，氧化应激（oxidative stress, OS）是活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成与清除之间的失衡，参与神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和代谢综合征等多种慢性病的病理过程。线粒体既是ROS的主要产生场所，也是ROS损伤的主要靶点；线粒体功能障碍与氧化应激可形成恶性循环。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）作为ω-3多不饱和脂肪酸，已被报道具有抗炎、抗肿瘤和心脏保护等作用，并可通过提高抗氧化酶活性、改善线粒体功能来减轻氧化损伤。然而，EPA本身结构高度不饱和，在特定条件下也可能表现出促氧化效应，其抗氧化机制尚不完全清楚。尤其是EPA是否通过microRNA（miRNA）这一表观遗传调控层协调多条下游通路，此前缺乏系统的机制验证。研究人员基于前期转录组筛选，鉴定出EPA处理HepG2细胞后变化最显著的let-7c-3p和miR-34c-5p，并围绕二者开展功能验证，旨在阐明EPA抗氧化作用的整合性上游调控机制。
在研究方法上，该研究以人类肝癌细胞系HepG2（RRID: CVCL_0027，购自中国科学院细胞库，2023年）为模型，使用100 μmol/L和150 μmol/L EPA处理细胞。主要技术方法包括：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miRNA和mRNA表达，Western blot检测蛋白水平，双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因3′-UTR直接结合，流式细胞术检测细胞内ROS、线粒体超氧化物和线粒体膜电位，ABTS与FRAP法测定总抗氧化能力，生化试剂盒检测CAT、SOD、GPx活性及ADP/ATP比值，并采用miRNA mimic、inhibitor和siRNA转染进行功能获得与功能缺失验证。
研究结果分述如下。
3.1 EPA下调let-7c-3p以介导其抗氧化活性：qRT-PCR显示EPA处理48 h后let-7c-3p显著下调。与单独EPA处理降低细胞内ROS相反，过表达let-7c-3p可显著增加ROS并削弱总抗氧化能力；在EPA存在时同时转染let-7c-3p mimic，EPA的ROS降低作用和抗氧化能力增强作用被完全消除，证明let-7c-3p下调是EPA发挥抗氧化效应所必需的上游事件。
3.2 EPA上调miR-34c-5p以增强抗氧化防御：qRT-PCR显示EPA处理可显著上调miR-34c-5p。抑制内源性miR-34c-5p单独即可升高ROS并降低总抗氧化能力；在EPA处理组中抑制miR-34c-5p可完全阻断EPA降低ROS、增强ABTS自由基清除能力和铁还原抗氧化能力（FRAP）的作用，表明miR-34c-5p上调对EPA增强细胞抗氧化防御系统不可或缺。
3.3 let-7c-3p/TFAM轴驱动线粒体生物发生与功能：双荧光素酶报告实验证实let-7c-3p可直接结合TFAM 3′-UTR；let-7c-3p mimic降低TFAM mRNA，抑制let-7c-3p则升高TFAM表达。功能上，抑制let-7c-3p或过表达TFAM均可增加线粒体DNA（mtDNA）拷贝数，上调ND1、COX1等线粒体编码基因以及PGC-1α、NRF1等核编码转录因子，同时提高ADP/ATP比值并减少线粒体超氧化物产生，说明该轴可促进线粒体生物发生并改善线粒体能量状态与氧化还原平衡。
3.4 miR-34c-5p/SIRT1轴通过直接增强酶促防御介导EPA的抗氧化效应：双荧光素酶报告实验证实miR-34c-5p直接靶向SIRT1 3′-UTR；miR-34c-5p过表达可降低SIRT1 mRNA水平。功能上，miR-34c-5p过表达或SIRT1敲低均可显著提高CAT、SOD和GPx的活性；而抑制miR-34c-5p可完全消除EPA诱导的上述酶活性升高，证明miR-34c-5p/SIRT1轴是EPA增强酶促抗氧化防御的关键通路。
3.5 miRNA-靶基因在蛋白水平的调控：Western blot结果显示，let-7c-3p mimic降低TFAM蛋白水平，EPA以浓度依赖方式升高TFAM蛋白；miR-34c-5p mimic降低SIRT1蛋白水平，EPA以浓度依赖方式降低SIRT1蛋白。这从蛋白水平进一步验证了两条miRNA-靶基因轴的真实调控关系。
讨论部分指出，let-7c-3p/TFAM轴是EPA靶向线粒体功能的主要机制，可在ROS产生的源头降低线粒体氧化压力；miR-34c-5p/SIRT1轴则通过增强核心抗氧化酶活性，提高细胞清除ROS的能力，两条轴相互补充，构成协同的抗氧化网络。SIRT1功能具有明显的背景依赖性，抑制SIRT1可能通过影响NRF2乙酰化状态而促进抗氧化酶表达，但精确机制仍需进一步研究。研究人员也指出，EPA调控两条miRNA表达的上游信号通路尚待阐明，两轴之间是否存在协同效应以及这些发现是否在体内模型中具有生理相关性，仍需后续工作加以验证。该研究的局限性包括仅在HepG2细胞中开展实验，以及所用EPA浓度（100～150 μmol/L）高于人体血浆中的生理水平。
结论方面，该研究揭示了EPA抗氧化活性的一种表观遗传机制：EPA通过下调let-7c-3p解除对TFAM的抑制，驱动线粒体生物发生并在源头减少ROS产生；同时通过上调miR-34c-5p抑制SIRT1，增强核心抗氧化酶活性。蛋白水平验证和功能拯救实验进一步确立了这两条miRNA-mRNA轴在EPA抗氧化效应中的必要性。这些发现深化了对ω-3多不饱和脂肪酸有益作用机制的理解，并提示靶向特定miRNA通路可能为氧化应激相关疾病的营养干预和治疗策略提供新靶点。
