《Food Frontiers》：Ligand Fishing for Xanthine Oxidase Inhibitors From Brassica rapa L. via Bioaffinity Ultrafiltration-HPLC-MS/MS: Mechanistic Insights and In Vitro Anti-Hyperuricemic Activity
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高尿酸血症是一种由嘌呤代谢紊乱引发的常见代谢性疾病，其中黄嘌呤氧化酶（XOD）是催化次黄嘌呤和黄嘌呤最终氧化为尿酸的关键限速酶。尽管已有报道表明芜菁（Brassica rapa L.，又称chamagu）具有抗高尿酸血症作用，但负责XOD抑制的特异性生物活性成
高尿酸血症是一种由嘌呤代谢紊乱引发的常见代谢性疾病，其中黄嘌呤氧化酶（XOD）是催化次黄嘌呤和黄嘌呤最终氧化为尿酸的关键限速酶。尽管已有报道表明芜菁（Brassica rapa L.，又称chamagu）具有抗高尿酸血症作用，但负责XOD抑制的特异性生物活性成分及其潜在机制仍不明确。本研究采用超滤-高效液相色谱-串联质谱（UF-HPLC-MS/MS）技术，从芜菁水提物中筛选出183种潜在的XOD抑制剂。结合分子对接与体外活性测定，补骨脂素被鉴定为有效的XOD抑制剂（IC50 = 0.237 ± 0.003 mg/mL），并被选作进一步表征的对象。在机制层面，补骨脂素以1:1的化学计量比自发结合XOD，主要驱动力为范德华力和氢键，这些作用诱导蛋白质微环境的局部构象扰动，从而抑制酶活性。在细胞模型中，补骨脂素显著降低黄嘌呤刺激的BRL-3A肝细胞中XOD活性及尿酸水平，同时通过降低超氧阴离子（O2·?）水平和恢复总抗氧化能力来缓解氧化应激。此外，在尿酸处理的HK-2肾小管细胞中，补骨脂素缓解了氧化应激（降低丙二醛（MDA）水平并提高超氧化物歧化酶（SOD）活性）和炎症反应（降低白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，并增加白细胞介素-10（IL-10）水平）。总之，这些发现阐明了芜菁通过靶向XOD发挥降尿酸作用的分子基础，为其作为功能食品的进一步开发与利用提供了实验依据。
论文解读：芜菁中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选及机制研究
高尿酸血症是一种因嘌呤代谢紊乱导致血清尿酸异常升高的慢性代谢性疾病，其患病率随饮食结构改变呈现上升趋势，并与痛风、肾损伤、心血管疾病及代谢综合征密切相关。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XOD）是尿酸生成途径中的关键限速酶，催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸，因此是临床降尿酸药物的重要靶点。现有XOD抑制剂如别嘌醇、非布司他等虽疗效确切，但存在心血管风险、肝毒性及严重皮肤过敏等不良反应。因此，从天然产物中筛选高效低毒的XOD抑制剂对高尿酸血症的辅助治疗及功能食品开发具有重要意义。芜菁（Brassica rapa L.，又称chamagu）是中国新疆地区典型的药食两用植物，具有抗氧化、抗炎和免疫调节等多种生物活性，其抗高尿酸血症作用在中医古籍中已有记载，但关键活性成分及分子机制尚不清楚。本研究旨在通过亲和超滤结合液质联用技术从芜菁中系统筛选XOD抑制活性成分，并阐明其作用机制，为芜菁的功能食品开发提供理论依据。
研究人员采集新疆阿克苏地区柯坪县的芜菁样品（GPS坐标：东经79.343，北纬40.520，批号10079358018775），采用水、70%乙醇和80%丙酮三种溶剂制备提取物。通过体外XOD活性测定筛选出活性最强的水提物后，使用超滤-高效液相色谱-串联质谱（UF-HPLC-MS/MS）技术结合非靶向代谢组学筛选潜在XOD配体。随后采用CB-Dock2分子对接、GROMACS分子动力学模拟（100 ns）、酶抑制动力学、稳态荧光滴定、圆二色谱（CD）和原子力显微镜（AFM）等技术系统解析活性化合物的抑制机制。在细胞层面，利用黄嘌呤诱导的BRL-3A大鼠肝细胞模型和尿酸诱导的HK-2人肾小管上皮细胞模型，通过CCK-8法、生化试剂盒和ELISA法评估补骨脂素的降尿酸、抗氧化及抗炎活性。
研究结果显示：三种芜菁提取物中，水提物对XOD的抑制活性最强，半数抑制浓度（IC50）为34.08 ± 0.71 mg/mL。UF-HPLC-MS/MS共鉴定出602种化合物，主成分分析显示XOD孵育后代谢谱显著改变，经差异筛选（p < 0.05，VIP > 1.0）获得183种差异化合物。结合分子对接和体外活性验证，补骨脂素（psoralen）以最低结合能（?9.3 kcal/mol）和IC50 = 0.237 ± 0.003 mg/mL被确定为关键XOD抑制剂。分子动力学模拟表明，补骨脂素与XOD复合物在5 ns后达到稳定，均方根偏差（RMSD）维持在约1.3 ?，回旋半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）波动小，氢键数量主要维持在0–4个，绝大多数氨基酸残基的均方根涨落（RMSF）低于4 ?，说明复合物具有良好的构象稳定性和结合稳定性。酶抑制动力学实验显示，Lineweaver–Burk双倒数图中各直线交于纵轴，随补骨脂素浓度增加斜率增大而纵截距不变，Ki值为2.813 × 10?? mol/L，表明补骨脂素是XOD的竞争性抑制剂。荧光滴定分析表明，补骨脂素以静态淬灭方式降低XOD内源荧光，淬灭常数（Ksv）随温度升高而减小，双分子淬灭速率常数（kq）达1011 L·mol?1·s?1量级；结合常数Ka在298、304、310 K下分别为9.82 × 103、3.98 × 103和1.66 × 103 L·mol?1，结合位点数n接近1；热力学参数显示ΔG < 0、ΔH = ?113.2 kJ/mol、ΔS = ?302.9 J/(mol·K)，表明结合过程自发进行，主要驱动力为范德华力和氢键，且以1:1比例结合。CD光谱显示，补骨脂素使XOD的α-螺旋比例轻度下降，β-折叠、β-转角和无规卷曲比例相应增加，说明其主要诱导蛋白质局部构象调整而对整体二级结构影响较小。AFM观察显示，补骨脂素处理后XOD颗粒在云母表面分布更密集、表面高度降低，但未出现明显无序聚集，进一步证实补骨脂素可与XOD直接结合并维持蛋白结构稳定性。
在BRL-3A肝细胞模型中，补骨脂素（100和200 μM）在不影响细胞活力的前提下，显著降低黄嘌呤诱导的细胞上清液尿酸水平和细胞内XOD活性；同时降低超氧阴离子（O2·?）水平并恢复总抗氧化能力（T-AOC），表明补骨脂素通过抑制XOD减少尿酸生成，并缓解氧化应激。在HK-2肾小管上皮细胞中，补骨脂素显著降低尿酸诱导的促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，升高抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）水平；同时降低脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量并提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，表明其能够缓解尿酸诱导的肾脏炎症和氧化应激损伤。
讨论部分指出补骨脂素作为线性呋喃香豆素类化合物，其平面芳香共轭骨架和适中极性的官能团有利于结合XOD活性位点，但相对于槲皮素、山柰酚等多酚类化合物及阳性药别嘌醇，其抑制活性属于中等水平，可能与实验条件（如酶活性和抑制剂与酶的比例）有关。研究从分子、蛋白和细胞多个层面系统揭示了补骨脂素通过竞争性结合XOD发挥降尿酸作用的机制，并验证了其对肝细胞和肾小管上皮细胞的保护活性，为芜菁作为功能食品的开发提供了实验依据。
研究结论：在三种不同溶剂制备的芜菁提取物中，水提物表现出最强的XOD抑制活性（IC50 = 34.08 mg/mL）。通过XOD亲和超滤-HPLC-MS/MS筛选出183种差异化合物，结合分子对接和体外XOD抑制实验确认补骨脂素为关键活性成分。机制研究表明，补骨脂素以1:1化学计量比通过范德华力和氢键自发结合XOD，形成稳定的竞争性抑制复合物，并主要通过局部微环境扰动而非整体结构破坏来抑制酶活性。细胞实验证实补骨脂素能够降低肝细胞内XOD活性和尿酸水平，缓解氧化应激，并减轻尿酸诱导的肾小管上皮细胞炎症和氧化损伤。本研究揭示了芜菁发挥XOD抑制作用的化学基础，为芜菁源功能产品的开发提供了理论依据；但补骨脂素的抗高尿酸血症活性仍需更多体内和临床实验加以验证。
