《IUBMB Life》：MMP9 Knockout by CRISPR-Cas9 Reduces Bladder Cancer Malignancy But Does Not Synergize With BCG and Anti-PD-L1 in an Orthotopic Mouse Model
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膀胱癌（Bladder cancer, BC）是全球第10大常见癌症，约占新发病例的5%。多种因素促进肿瘤进展，包括基质金属蛋白酶9（MMP9）表达升高。近年来，CRISPR-Cas9和免疫治疗为治疗提供了高特异性；因此，研究人员采用CRISPR-Cas9方法
膀胱癌（Bladder cancer, BC）是全球第10大常见癌症，约占新发病例的5%。多种因素促进肿瘤进展，包括基质金属蛋白酶9（MMP9）表达升高。近年来，CRISPR-Cas9和免疫治疗为治疗提供了高特异性；因此，研究人员采用CRISPR-Cas9方法编辑MMP9以抑制转移机制，并评估其与卡介苗（BCG）和抗程序性死亡配体1（anti-PD-L1）治疗的潜在协同作用。研究人员在MB49小鼠膀胱癌细胞系中使用核糖核蛋白复合物（RNP complex）进行CRISPR-Cas9基因编辑，分析了基质金属蛋白酶（MMPs）、整合素和BAX的基因表达及蛋白表达。细胞分为Scramble对照组和CRISPR-Cas9编辑的MMP9缺失组（MMP9-/-）。雌性C57BL/6小鼠接受原位膀胱癌细胞（Scramble和MMP9-/-组），并接受BCG和anti-PD-L1治疗。统计分析采用t检验或方差分析（ANOVA）。与Scramble组相比，MMP9-/-组的MMP9基因和蛋白表达降低，其他MMPs未见差异。MMP9-/-组出现整合素β3（ITGB3）表达降低、BAX基因表达升高，以及迁移和细胞外基质（ECM）粘附能力下降。Scramble组动物较治疗组表现出更大的体重下降和更低的生存率。总体而言，MMP9调节了关键细胞机制，但在体内未显示与BCG和anti-PD-L1的协同效应。
膀胱癌（Bladder cancer, BC）是全球第10大常见恶性肿瘤，每年约有54.9万新发病例和19.9万死亡病例，吸烟是主要风险因素。晚期患者常采用以顺铂为基础的化疗，但部分患者应答不佳，亟需深入理解其分子机制。基质金属蛋白酶（MMPs）家族可降解细胞外基质（ECM），其中MMP9在肿瘤进展和复发中发挥重要作用。CRISPR-Cas9基因编辑技术和免疫治疗（包括BCG和抗PD-L1）为膀胱癌治疗提供了新策略，但MMP9在肿瘤行为调控及其与免疫治疗联合效果中的作用仍不清楚。因此，该研究旨在利用CRISPR-Cas9敲除MMP9，评估其对膀胱癌恶性行为的影响，并探讨与BCG和抗PD-L1联合治疗的协同潜力。
研究人员在MB49小鼠膀胱癌细胞系中通过CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物编辑MMP9，建立MMP9敲除细胞（MMP9
-/-）。体外实验检测了基因和蛋白表达、迁移、凋亡、增殖及对ECM的粘附能力；体内实验采用雌性C57BL/6小鼠原位膀胱癌模型，给予BCG膀胱灌注和抗PD-L1腹腔注射。结果显示，MMP9敲除显著降低MMP9基因和蛋白表达，但不影响其他MMPs（MMP2、MMP13、MMP14）；同时降低整合素ITGB3表达、升高促凋亡基因BAX表达，并抑制细胞迁移和ECM粘附，促进早期凋亡，但不影响增殖。体内实验中，治疗组动物体重下降更少、生存率更高，但MMP9敲除与BCG和抗PD-L1联合未显示协同效应。该研究揭示了MMP9在维持膀胱癌细胞侵袭行为中的重要作用，为优化联合治疗策略提供了实验依据。论文发表在《IUBMB Life》。
主要技术方法：利用CRISPR-Cas9 RNP复合物转染MB49细胞实现MMP9敲除；采用实时定量PCR和Western blot验证基因及蛋白表达，免疫荧光检测Cas9和MMP9。划痕实验评估迁移能力，流式细胞术检测凋亡和增殖；通过猪膀胱脱细胞获得ECM，进行再细胞化粘附实验。体内实验使用C57BL/6雌性小鼠（每组8只）原位接种Scramble或MMP9
-/-细胞，并分组接受BCG和抗PD-L1治疗，动态监测体重、生存率并作组织病理分析。
**3.1 CRISPR-Cas9对MB49细胞系中MMP9的基因编辑**
通过CRISPR-Cas9编辑，MMP9
-/-组MMP9基因和蛋白表达较Scramble组显著降低，其他MMPs（MMP2、MMP13、MMP14）无显著变化；整合素ITGB3表达下降，BAX表达升高。光学显微镜下可见MMP9
-/-细胞形态更小、更紧密，Scramble组细胞形态不规则。划痕实验显示MMP9
-/-组迁移率在24 h和48 h均显著低于Scramble组。流式细胞术检测显示MMP9
-/-组早期凋亡率升高，而晚期凋亡、总凋亡和增殖无显著差异。在猪膀胱脱细胞ECM上，MMP9
-/-组粘附的细胞数量明显少于Scramble组，提示MMP9敲除削弱了肿瘤细胞与ECM的相互作用。
**3.2 体内研究**
原位小鼠模型中，Scramble组体重下降最明显、生存率最低；接受BCG和抗PD-L1治疗的两个组体重下降较轻、生存率较高。肉眼观察显示所有动物均形成肿瘤，但治疗组肿瘤出血和新生血管减少。组织病理学（H&E染色）显示所有肿瘤均为高级别、侵袭性尿路上皮癌；Scramble+治疗组肿瘤侵袭性低于未治疗Scramble组，而MMP9
-/-组（无论是否治疗）仍表现为侵袭性肿瘤，说明MMP9敲除与BCG和抗PD-L1治疗在体内无协同增效作用。
讨论部分指出，MMP9敲除可影响细胞形态、整合素表达和凋亡相关基因，与既往文献一致；体内实验中BCG和抗PD-L1单独治疗有保护作用，但联合MMP9敲除未进一步改善效果。研究局限性在于原位模型中无法在实验过程中实时测量肿瘤体积。结论为：CRISPR-Cas9靶向MMP9的基因编辑有效且可重复，显著降低MMP9表达；MMP9编辑增加细胞凋亡（BAX升高和早期凋亡增加），减少迁移和ECM粘附，表明MMP9在维持肿瘤细胞形态和侵袭行为中发挥关键作用；在体内模型中，虽然治疗有获益，但MMP9抑制联合BCG和抗PD-L1未见额外优势。
