《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Innovative In Vivo Approaches to Bone Regeneration: Combining Chitosan-Xanthan Gum Membranes, Electrical Stimulation, and Laser Therapy
编辑推荐：
临界骨缺损因其致残性及高昂费用带来重大临床挑战。组织工程提供了一种具有前景的解决方案，采用多孔壳聚糖（CH）和黄原胶（XG）膜等生物材料作为组织再生的支架。电刺激（ES）和激光（L）治疗分别以成骨和抗炎作用著称，当与这些膜联合使用时，可能协同增强骨愈合。本
临界骨缺损因其致残性及高昂费用带来重大临床挑战。组织工程提供了一种具有前景的解决方案，采用多孔壳聚糖（CH）和黄原胶（XG）膜等生物材料作为组织再生的支架。电刺激（ES）和激光（L）治疗分别以成骨和抗炎作用著称，当与这些膜联合使用时，可能协同增强骨愈合。本研究评估了CH/XG膜及其与ES和L联合治疗对80只雄性Wistar大鼠中创建的临界骨缺损（25 mm2）的治疗效果。动物被分为四组：未治疗组、CH/XG组、CH/XG+ES组和CH/XG+L组，在第30天和第90天进行评估。组织形态计量学和实时PCR分析显示，与未治疗组相比，CH/XG、CH/XG+ES和CH/XG+L组的组织和血管形成更多。在第30天，治疗组中Runx-2和Osx表达降低，提示初期高炎症反应。CH/XG组表现出明显炎症（Il-1β和促炎标志物升高）同时伴随抗炎反应。相反，与仅CH/XG组相比，CH/XG+ES和CH/XG+L组在30天后通常表现出所评估促炎标志物的较低表达，同时抗炎标志物呈治疗和时间依赖性变化。尽管炎症限制了CH/XG膜的初期效果，但在90天后观察到显著的积极影响。如本研究所示，将覆盖骨缺损的膜与辅助治疗相结合，是增强骨修复结果的有益方法。添加骨传导性或骨诱导性填充材料可能带来进一步的愈合改善。
**论文解读**
**一、研究背景与问题**
骨组织是一种高度特化的动态结缔组织，为肌肉和肌腱提供结构支撑，保护内脏器官并容纳骨髓。骨组织虽具有自发再生能力，但该能力受骨缺损尺寸限制。当缺损达到临界尺寸时，自发再生便成为临床挑战。传统临床干预措施费用高昂且具有致残性，因此需要更高效、经济的替代方案。组织工程方法结合定制生物材料的开发为这一问题提供了解决途径。在众多用于膜制备的材料中，壳聚糖（chitosan, CH）和黄原胶（xanthan gum, XG）等多糖因其独特性能和潜在骨组织工程应用而受到关注。CH是由甲壳素脱乙酰化衍生的阳离子聚合物，具有生物相容性和可生物降解性；XG是由野油菜黄单胞菌合成的阴离子聚合物，同样具有生物相容性、可生物降解性和无毒性。CH与XG结合后形成聚电解质复合物，可制备具有增强机械性能、在pH变化下稳定并能吸收大量水溶液的生物材料。
鉴于骨再生的动态特性，将生物材料与电刺激（electrical stimulation, ES）和低强度激光治疗（laser therapy, L）等辅助疗法相结合已引起关注。ES通过模拟生理电信号促进成骨细胞合成、增殖和分化；L通过调节成骨关键生物学过程，增强成骨细胞增殖、胶原合成、骨基质形成和肉芽组织发育。然而，要充分挖掘ES和L的再生潜力，需探索其与生物材料联合如何影响免疫调节和支持组织修复。巨噬细胞作为免疫系统关键介质，通过在促炎（M1）和抗炎（M2）表型间转换，在协调骨再生中发挥核心作用。生物材料可通过理化性质、表面形貌和生化线索影响巨噬细胞行为，引导免疫反应朝向再生性特征发展。因此，本研究旨在体内条件下探究多孔壳聚糖-黄原胶膜与无创骨再生疗法（电刺激和低强度激光治疗）联合应用是否能调节免疫反应和成骨过程，以优化骨再生。
**二、研究设计与技术方法**
本研究为随机对照体内实验，经机构动物护理和使用委员会（CEUA）批准（协议号055/2017），遵循巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）伦理原则。共使用80只雄性Wistar大鼠（平均体重300±50 g，90日龄）。动物接受氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后，在颅骨区域创建25 mm2（5 mm×5 mm）的临界尺寸缺损。将8 mm直径的圆形CH/XG膜覆盖于缺损处，无需额外固定。动物随机分为四组：未治疗对照组、CH/XG组、CH/XG+ES组和CH/XG+L组，每组在术后30天和90天各设亚组（n=10/组/时间点）。ES治疗使用低强度经皮电刺激器，在缺损周围放置两个金属电极，以10 μA电流持续5分钟，术后立即开始，每周两次。L治疗采用AsGaAl激光（808 nm，连续模式，输出功率100 mW，光束面积0.0275 cm2，能量密度90.18 J/cm2，持续25秒），在缺损周围四个位置施加，术后立即开始，每周两次。
样本采集方面，术后第30天和第90天每组10只动物在麻醉下处死，收集缺损区域骨样本。4个样本经10%甲醛固定后进行组织形态计量学分析，6个样本冷冻于?80°C用于实时PCR分析。组织样本经脱钙、脱水、石蜡包埋后制备4.0 μm切片，Masson三色染色用于定量结缔组织和血管。采用ImageJ软件进行图像分析，定量胶原阳性细胞外基质面积百分比和血管计数。分子分析方面，使用TRIzol试剂提取总RNA，经反转录合成cDNA，采用TaqMan探针进行实时定量PCR（RT-qPCR），检测成骨相关基因（Runx-2、Osx）和炎症相关基因（Cd68、Cd86、Arg-1、Il1rn、Il-1β），以Gapdh作为内参基因，采用2
?ΔΔCt法计算相对表达量。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Bonferroni事后检验（参数数据）或Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验（非参数数据）。
**三、研究结果**
**组织形成**
组织形态计量学分析显示，在第30天，各组间胶原阳性细胞外基质面积百分比相似。在第90天，CH/XG组较未治疗组显示出显著更大的胶原阳性面积。血管计数方面，第30天各组间无显著差异；第90天，CH/XG组血管计数显著高于未治疗组，而CH/XG+ES和CH/XG+L组数值较高但未达统计学显著差异。
**成骨基因表达**
Runx-2表达方面，第30天CH/XG组表达水平与未治疗组相似，而CH/XG+ES和CH/XG+L组表达低于未治疗组和CH/XG组。第90天，三个治疗组的Runx-2表达均高于未治疗组，其中CH/XG+L组表达量约为未治疗组的8倍。Osx表达方面，第30天三个治疗组表达均降低，约为未治疗组的0.5倍。第90天，CH/XG+ES组表达较未治疗组增加约3倍，CH/XG+L组增加近2倍。
**促炎基因表达**
Cd68表达方面，第30天CH/XG组高于未治疗组和CH/XG+L组，第90天无显著差异但治疗组均呈较高趋势。Cd86表达方面，第30天CH/XG组较未治疗组增加约10倍，CH/XG+ES组约5倍，CH/XG+L组约2.5倍；第90天CH/XG+L组较对照组增加约30倍，CH/XG组约15倍，CH/XG+ES组约10倍。Il-1β表达方面，第30天CH/XG组较未治疗组增加约15倍，CH/XG+ES组约5倍，CH/XG+L组约4倍；第90天各组间无统计学差异，但CH/XG+L组和CH/XG+ES组分别呈现约8倍和6倍增加趋势，而CH/XG组表达低于未治疗组。
**抗炎基因表达**
Arg-1表达方面，第30天CH/XG组较对照组增加约18倍，CH/XG+ES组约5倍，CH/XG+L组与对照组相似；第90天无统计学差异，但CH/XG+L组呈现约5倍增加趋势。Il1rn表达方面，第30天CH/XG组较未治疗组增加约15倍；第90天CH/XG+L组较未治疗组增加约30倍，CH/XG+ES组约10倍，CH/XG组约8倍。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，研究主要假设是CH/XG膜能支持临界尺寸骨缺损的修复环境。胶原阳性细胞外基质面积和血管计数的组间差异，尤其是在第90天，表明含膜治疗方案与组织修复结果相关，但由于未设置单独ES和L治疗对照组，无法确定这些物理模态的独立效应。成骨标志物分析显示，治疗后第30天成骨基因表达降低，可能反映初期高炎症反应；第90天骨相关转录因子表达升高，提示成骨信号通路激活。炎症方面，CH/XG组在第30天表现出促炎和抗炎基因同时高表达的特征，提示膜周围组织同时存在促炎和修复相关信号。CH/XG+ES和CH/XG+L组呈现不同于CH/XG单独治疗的炎症基因表达谱，联合治疗组促炎标志物表达通常较低。Cd68被解释为泛巨噬细胞相关标志物而非M1特异性标志物，基因表达结果不能单独确立巨噬细胞表型、定位或极化状态。Arg-1和Il1rn被解释为抗炎/修复相关标志物，而非M2巨噬细胞极化的确证证据。
研究讨论还强调，CH/XG膜设计为骨膜替代物，提供结构支撑并保护缺损部位。缺损内缺乏填充材料可能限制再生过程，单独使用膜可能不足以稳定缺损或促进充分骨形成。已有研究表明，无论使用何种类型膜，骨移植材料存在对新生骨形成可能至关重要。因此，膜与骨传导性或骨诱导性填充材料联合似乎是最大化临界尺寸缺损成功骨再生潜力的必要策略。
研究结论为：在大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中，含CH/XG膜的治疗方案与胶原阳性细胞外基质、血管计数、成骨基因和炎症基因表达的治疗和时间依赖性变化相关。CH/XG单独使用产生明显的早期促炎和抗炎相关基因表达，而CH/XG+ES和CH/XG+L组表现出不同表达谱。第90天，部分含膜组表现出高于未治疗组的血管和成骨标志物数值。由于未设置单独ES和L对照组，这些结果不能确立任一模态的独立效应或证明与膜的协同作用。膜表现出成骨潜力，但需评估其他成骨标志物以进一步证实。因此，使用膜覆盖骨缺损并结合骨传导性或骨诱导性材料填充缺损以及辅助疗法，可能进一步改善愈合结果。建议未来研究纳入单独模态对照组、三维矿化组织成像、蛋白质水平分析和骨传导性或骨诱导性填充材料，以确定这些联合方法能否改善功能性骨再生。该论文发表在《Journal of Biomedical Materials Research Part A》。
