《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Furong Tongmai Capsule Ameliorates Atherosclerosis in ApoE?/? Mice by Modulating Gut Microbiota, Arachidonic Acid Metabolism and Macrophage Polarization
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摘要
芙蓉通脉胶囊（FRTM）是一种传统中药复方，具有降脂和抗炎活性，但其在动脉粥样硬化（AS）中的作用机制尚不清楚。在高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠中，FRTM给药通过降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇并升高高密度脂蛋白胆固醇，改善了血清脂质谱。
摘要
芙蓉通脉胶囊（FRTM）是一种传统中药复方，具有降脂和抗炎活性，但其在动脉粥样硬化（AS）中的作用机制尚不清楚。在高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠中，FRTM给药通过降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇并升高高密度脂蛋白胆固醇，改善了血清脂质谱。FRTM还减轻了主动脉病变形成，降低了促炎细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）水平，并改善了氧化应激指标。16S rRNA测序显示，FRTM重塑了肠道菌群，增加了乳杆菌属和双歧杆菌属等有益菌群，同时减少了Turicibacter属。功能预测和非靶向血清代谢组学均提示花生四烯酸代谢是受FRTM影响的关键通路。此外，FRTM与p-PPARγ和EP4表达增加、p-P65降低以及p-STAT3/STAT3升高相关，同时伴有M1标志物（iNOS/Nos2）下调和M2标志物（CD206和ARG1）上调。来自FRTM处理供体的粪便菌群移植部分重现了抗动脉粥样硬化和抗炎效应。总体而言，这些发现表明FRTM可能通过调节肠道菌群、花生四烯酸代谢和巨噬细胞极化改善小鼠模型中的AS；然而，仍需进一步的功能研究来确定因果关系并评估转化相关性。
论文解读
一、研究背景与问题
动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是一种以脂质沉积和白细胞浸润为特征的慢性进行性动脉炎症性疾病，是缺血性心脏病、心肌梗死和脑卒中等多种心血管疾病的重要危险因素。尽管目前已有降脂药物、抗炎药物和外科手术等常规治疗手段，但全球AS相关心血管疾病负担仍持续上升，且长期用药可能带来肝肾毒性、耐药性等问题，手术干预成本高且具有侵入性。因此，寻找新的治疗策略是现代医学面临的重大挑战。
近年来，越来越多的证据表明肠道菌群在调节心血管疾病风险中发挥关键作用。代谢组学研究发现，肠道菌群组成和功能的改变与代谢紊乱、炎症及动脉粥样硬化斑块形成密切相关。传统中药（TCM）以其整体调节的特点，在通过肠道菌群调控和代谢通路调节来缓解AS方面受到关注。已有研究表明，灵芝多糖、定心方IV号、冠心宁片等中药可通过调节肠道菌群及其代谢产物发挥抗AS作用。肠道菌群失调可通过直接产生或修饰类二十烷酸、经微生物代谢物调节宿主AA代谢酶、以及通过系统性炎症释放膜磷脂中的AA等途径改变宿主花生四烯酸（AA）代谢。AA代谢可能是肠道菌群失调与血管炎症之间的关键界面。AA经环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450途径代谢生成前列腺素、血栓素和白三烯等生物活性类二十烷酸，其中前列腺素E2（PGE2）和15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2（15d-PGJ2）等AA衍生代谢物通过EP4/STAT3和PPARγ/NF-κB信号轴参与巨噬细胞极化调控，进而影响炎症消退和斑块进展。
芙蓉通脉胶囊（FRTM）由水蛭、地龙、全蝎、黄芪、当归、玄参、葛根、穿山龙、何首乌、川牛膝和甘草组成，临床实践中显示出对心血管疾病的潜在益处，但其在AS中的作用机制尚不清楚。基于肠道菌群失调、AA代谢与巨噬细胞极化之间的关联，研究人员提出假说：FRTM可能通过重塑肠道菌群，进而调节AA代谢和下游炎症信号来改善AS。
二、研究方法概述
研究人员使用高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠建立AS模型，设置对照组、模型组、阿托伐他汀组以及FRTM低、中、高三个剂量组（每组10只）。主要技术方法包括：血清生化指标和ELISA检测（血脂谱、氧化应激指标和炎症因子）；主动脉根部病理染色（HE染色和油红O染色）评估斑块面积；16S rRNA高通量测序分析肠道菌群组成和多样性，并进行PICRUSt2功能预测；非靶向血清代谢组学（LC-MS）结合PCA、PLS-DA和多变量分析筛选差异代谢物及富集通路；Western blot检测PPARγ/NF-κB和EP4/STAT3通路蛋白表达；RT-qPCR检测炎症因子和巨噬细胞极化标志物mRNA水平；并采用粪便菌群移植（FMT）实验，将FRTM高剂量组供体粪便悬液经灌胃给予受体ApoE?/?小鼠（Model+FRTM-H→Model组），验证肠道菌群在FRTM抗AS效应中的作用。小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号SCXK（北京）2020-0004）。FMT实验中，受体小鼠未预先接受抗生素清除或使用无菌小鼠，因此定植可能不完全，结果仅作为支持性证据。
三、研究结果
3.1 FRTM治疗改善相关病理改变和生化指标
HE染色显示，模型组小鼠主动脉出现内皮损伤、纤维斑块、钙化和局部炎症浸润，而阿托伐他汀组和各FRTM剂量组均表现出不同程度的病变改善，包括内皮细胞脱落减少、结构更完整、平滑肌细胞形态规则、纤维斑块和钙化减少、无明显的炎症浸润。油红O染色显示模型组血管腔不规则，有明显粥样斑块和脂滴沉积，FRTM干预后斑块面积和脂滴程度呈剂量依赖性减轻。定量分析显示，与对照组相比，模型组相对病变面积显著升高，FRTM各剂量组和阿托伐他汀组均显著降低相对病变面积。血清脂质检测表明，模型组TC、TG、LDL-C明显升高，HDL-C明显下降；FRTM各剂量组能显著降低TC、TG、LDL-C水平并升高HDL-C，且高剂量FRTM效果与阿托伐他汀相当。
3.2 FRTM抑制AS小鼠氧化应激和炎症因子水平
与对照组相比，模型组血清SOD和GSH-Px活性显著降低，MDA水平显著升高；FRTM中、高剂量和阿托伐他汀干预后显著提高SOD和GSH-Px活性并降低MDA水平。同时，ELISA结果显示模型组血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高，FRTM中、高剂量和阿托伐他汀治疗显著降低这些促炎细胞因子水平。
3.3 FRTM疗法影响AS小鼠肠道菌群
16S rRNA测序分析显示，与对照组相比，模型组α多样性（Shannon和Simpson指数）受AS影响显著改变，FRTM处理后得到恢复。PCoA显示模型组与正常组样本明显分离，FRTM组与正常组接近。在门水平上，模型组Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值较对照组显著升高，而FRTM-H组F/B比值较模型组显著降低。在属水平上，模型组Turicibacter相对丰度升高，而Lactobacillus、Muribaculaceae、Bifidobacterium、Faecalibaculum和Alloprevotella相对丰度降低；FRTM治疗逆转了这些变化，增加了有益菌属并减少了Turicibacter。
3.4 微生物功能预测分析
PICRUSt2功能预测显示，FRTM-H干预主要调节了环境信息处理、能量代谢和AA代谢等通路。
3.5 FRTM调节AS小鼠多种代谢物
非靶向代谢组学PCA和PLS-DA显示各组间代谢谱明显分离。筛选差异代谢物（VIP>1，p<0.05，FC>1.2或<0.8）后进行通路富集分析，结果表明FRTM治疗调节了AA代谢、嘧啶代谢和类固醇激素生物合成等通路。Spearman相关分析显示Lactobacillus、Muribaculaceae、Bifidobacterium、Turicibacter、Faecalibaculum、Alloprevotella与大多数代谢物存在显著相关性。将16S rRNA功能预测与代谢组学通路富集结果取交集，发现AA代谢是FRTM-H处理涉及的共同通路。
3.6 FRTM调节PPARγ/NF-κB和EP4/STAT3通路以抑制炎症相关因子表达
代谢组学显示FRTM升高了PGE2、PGJ2和PGB2水平，降低了PGG2和TXB2水平。Western blot结果表明，FRTM处理增加p-PPARγ/PPARγ表达、降低p-P65/P65表达，同时增加EP4表达和p-STAT3/STAT3比值。RT-qPCR结果显示，FRTM治疗降低Il1b、Il6和Tnfa mRNA水平并升高Il10 mRNA水平。
3.7 FRTM抑制巨噬细胞极化
RT-qPCR显示FRTM治疗下调Nos2表达，上调Cd206和Arg1表达。Western blot结果一致显示FRTM降低iNOS蛋白水平，增加CD206和ARG1蛋白水平，表明FRTM促使巨噬细胞向M2样表型偏移。
3.8 FMT（Model+FRTM-H→Model组）部分改善AS相关病理、生化指标、氧化应激和炎症
来自FRTM-H供体的粪便菌群移植后，受体小鼠主动脉病变面积较Model→Model组有不同程度改善，油红O染色显示斑块面积和脂滴减少。FMT还降低了血清TC、TG、LDL-C，升高了HDL-C；提高了SOD和GSH-Px活性，降低了MDA水平；并降低血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。
3.9 FMT与改善巨噬细胞极化和减轻炎症相关，伴有PPARγ/NF-κB和EP4/STAT3信号改变
FMT组（Model+FRTM-H→Model）与Model→Model组相比，p-PPARγ表达增加，p-P65减少，EP4表达升高，p-STAT3/STAT3比值增加。RT-qPCR显示受体小鼠Il1b、Il6、Tnfa mRNA水平降低，Il10升高；Nos2下调，Cd206和Arg1上调。Western blot显示iNOS降低、CD206和ARG1升高。这些结果提示供体FRTM处理的粪便菌群可部分重现直接FRTM治疗的抗炎表型。
四、讨论与结论
讨论部分指出，FRTM治疗与降低TC、TG、LDL-C并升高HDL-C、改善主动脉病理相关，高剂量FRTM疗效与阿托伐他汀相当。FRTM的疗效与肠道菌群调节密切相关：增加的有益菌如Lactobacillus可减轻氧化应激和炎症并调节胆固醇代谢；Bifidobacterium可减少内脏脂肪并缓解高脂饮食诱导的肥胖；Faecalibaculum丰度与短链脂肪酸（SCFA）产生相关；Alloprevotella与脂质谱负相关，并通过GLP-1分泌和米色脂肪诱导改善葡萄糖代谢和胰岛素敏感性。FRTM可能通过直接调节AA代谢酶（如阿魏酸、葛根素影响类二十烷酸生物合成）、通过菌群重塑间接调节宿主AA代谢（如SCFA和次级胆汁酸影响炎症信号和脂质介质谱），以及富集的有益菌与宿主脂肪酸代谢的串扰等机制影响AA代谢。FRTM升高抗炎前列腺素（PGE2、PGJ2）并降低促炎代谢物（PGG2、TXB2），通过PPARγ/NF-κB和EP4/STAT3通路调节炎症和巨噬细胞极化。FMT实验支持肠道菌群在FRTM抗AS效应中的潜在贡献，但由于受体未经抗生素清除或无菌处理，定植不完全，结果应视为支持性而非因果性证据。研究局限性包括主动脉切片取自斑块所在水平而非标准的三叶瓣主动脉瓣窦平面，且未进行通路特异性功能验证（如药理学抑制、siRNA敲低或基因敲除）。总体而言，FRTM是潜在的AS干预候选药物，未来需结合通路干扰和菌群条件化模型以确定因果关系。
研究结论：在这项临床前研究中，FRTM改善了ApoE?/?小鼠的血清脂质谱和主动脉病理。整合的微生物组和代谢组学分析表明这些效应可能与花生四烯酸代谢有关。FRTM治疗伴随巨噬细胞极化改变以及PPARγ/NF-κB和EP4/STAT3信号的变化，同时减轻炎症反应。然而，由于这些发现主要是关联性的，仍需额外的功能研究来确定这些通路是否因果性地参与FRTM的抗动脉粥样硬化作用。
