《Journal of Forensic Sciences》：Effects of bleach on carcass postmortem microbiomes and necrophagous beetle carcass attendance and their internal microbiomes
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法医昆虫学，以及未来可能应用的微生物学，可在死亡调查中用于佐证估计的死后时间间隔。当尸体被引入某些物质（无论出于掩盖目的还是意外），都可能影响相关分解者类群（即昆虫和细菌）的分解与演替。本研究使用重复（每种处理n=5）的死产猪尸体，测试了两次漂白剂（次氯酸钠）
法医昆虫学，以及未来可能应用的微生物学，可在死亡调查中用于佐证估计的死后时间间隔。当尸体被引入某些物质（无论出于掩盖目的还是意外），都可能影响相关分解者类群（即昆虫和细菌）的分解与演替。本研究使用重复（每种处理n=5）的死产猪尸体，测试了两次漂白剂（次氯酸钠）浸泡对户外分解过程中尸体、土壤及甲虫死后微生物组的分解和演替的影响。每隔两天对甲虫、尸体及其下方土壤的微生物组样本进行测序。在分解过程中，从陷阱中收集的甲虫群落在经漂白处理与对照组尸体之间无显著差异；然而，直到实验最后一天，从经漂白处理的尸体收集到的甲虫数量较少。16S rRNA扩增子测序结果显示，尸体及其下方土壤的微生物组在尸体经漂白处理后未发生显著变化，甲虫内部微生物组也未受漂白剂添加的影响。使用两种处理尸体下方土壤微生物组进行随机森林建模，预测野外放置后时间的成功率为74.4%；使用甲虫内部微生物组建模预测甲虫科的成功率为74.0%。向尸体引入漂白剂并未影响微生物或甲虫群落、总分解时间，也未降低放置时间模型的准确性。
论文解读：漂白剂对尸体分解相关微生物组和食尸甲虫的影响
在法医调查中，估计死后时间间隔（postmortem interval, PMI）常依赖昆虫演替和微生物群落变化。尸体在分解过程中，体表和体内的细菌群落按可预测的次序演替，例如初期以变形菌门（Proteobacteria）为主，活跃及晚期腐败阶段厚壁菌门（Firmicutes）增多。这些微生物代谢产生的挥发性有机化合物（VOCs）可吸引不同种类的腐食性昆虫。食尸甲虫（Coleoptera）是重要的法医昆虫，其群落演替和发育数据可用于估计最短死后时间间隔（PMImin）。然而，当尸体被人为引入化学物质，如漂白剂（次氯酸钠），可能改变微生物群落和昆虫行为，从而干扰法医推断。漂白剂易得且常用于掩盖尸体，能降解DNA、灭活病毒并杀灭细菌。已有研究表明，漂白剂会延迟丽蝇产卵并影响其发育，但对甲虫及其内部微生物组的影响尚不清楚。此外，尸体下方土壤会形成尸体分解岛（cadaver decomposition island, CDI），其中的微生物群落变化也可能受化学物质影响。因此，研究人员提出假说：漂白剂的抗菌活性会负面干扰甲虫对尸体的吸引和定殖，并可能延缓分解进程。
为验证假说，研究人员从密歇根州立大学猪教学与研究设施购买了10头死产猪尸体（该研究无需IACUC批准），随机分为漂白处理组（n=5）和对照组（n=5）。处理组尸体在实验开始当天于实验室中用10%次氯酸钠溶液浸泡两次，每次2分钟，随后用去离子水浸泡两次；对照组仅用去离子水浸泡。所有尸体置于密歇根州立大学昆虫学野外与研究中心的林地边缘，每个尸体由防食腐动物笼保护。每具尸体周围设置三个陷阱（pitfall traps）被动收集甲虫，每日两次观察分解阶段（依据Payne [23]定义），并采集尸体口、直肠和表面拭子及下方土壤样本。从陷阱中收集的甲虫立即保存在RNAlater中。由于资源限制，仅在奇数日采集的甲虫进行鉴定和测序。所有样本的DNA提取后，对16S rRNA基因V4区进行扩增子测序（Illumina MiSeq平台）。生物信息学流程包括QIIME2、DADA2去噪、SILVA数据库注释、系统发育树构建。多样性分析采用Shannon指数和Inverse Simpson指数，β多样性采用加权UniFrac距离和PERMANOVA。随机森林模型用于预测采样日、处理或甲虫科等元数据。所有统计在R软件中完成。
研究结果如下。
3.1 分解进程：漂白处理未改变尸体达到白骨化的总时间（实验第9天全部完成），但改变了各阶段持续时间。对照组观察到典型的膨胀期（bloat stage），而漂白组未观察到明显膨胀期，直接从新鲜期进入活跃腐败期。漂白组丽蝇产卵平均延迟4.8小时；第3天下午所有尸体均出现蝇卵或幼虫。峰值丽蝇幼虫群体活动出现在第5至第6天，处理间无肉眼可见差异。
3.2 甲虫群落：共收集到10科甲虫，其中Nitidulidae、Silphidae和Chrysomelidae仅出现于对照组，Elateridae仅出现于漂白组。从漂白组收集的甲虫总数在实验前8天持续低于对照组，但最后一天趋向一致。两因素方差分析显示，收集时间与处理对甲虫数量无显著交互作用，Shannon多样性无显著差异，Simpson多样性仅在特定时间点有差异。主坐标分析（PCoA）显示，处理组与对照组的甲虫群落结构无显著差异，但后期群落趋于分离。Carabidae和Staphylinidae为优势科，初期Carabidae相对丰度较高，后期Staphylinidae成为最丰富类群。
3.3 尸体微生物组：α多样性方面，皮肤微生物组的Shannon多样性和丰富度在处理和时间间有显著差异，口腔微生物组也存在处理和时间效应，直肠则无显著变化。β多样性显示，不同体区（口、直肠、皮肤）的微生物组结构显著不同，且随时间显著变化，但漂白处理未显著改变任何体区的微生物群落结构。在分解初期，Moraxellaceae和Lactobacillaceae相对丰度较高，后期Wohlfahrtiimonadaceae和Planococcaceae增多。随机森林模型无法高准确率预测体区或采样日（体区预测OOB误差44.2%，合并所有体区预测采样日误差39.5%），但模型识别出分解早期（第1、3天）重要的科为肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和Wohlfahrtiimonadaceae，后期（第7、9天）为Planococcaceae和Wohlfahrtiimonadaceae。
3.4 土壤微生物组：从漂白组尸体下方土壤中获得的α多样性指标（丰富度、Shannon指数、Inverse Simpson指数）显著高于对照组，但1米外的对照土壤无差异。β多样性显示，随时间变化显著，但处理对下方土壤群落结构无显著影响；下方土壤与1米外土壤显著不同。分解早期（第1、3天）与后期（第5、7、9天）群落显著差异。分解后期Wohlfahrtiimonadaceae和Planococcaceae相对丰度增加。随机森林模型使用下方土壤微生物组预测采样日时，OOB误差为25.6%；若分别用对照组或漂白组建模，误差增至54.6%和42.9%。重要指示分类群包括Nitrosomonadaceae（第1、3天）、Moraxellaceae和Wohlfahrtiimonadaceae（第5天）以及Planococcaceae和Wohlfahrtiimonadaceae（第7、9天）。
3.5 甲虫内部微生物组：不同科甲虫的内部微生物组α多样性差异较大，其中Trogidae多样性和丰富度最高。PERMANOVA显示，甲虫内部微生物组结构在不同科间显著不同，并随时间变化，但处理（漂白与否）无显著影响。Staphylinidae内部富含Wohlfahrtiimonadaceae（相对丰度高达75%），Carabidae富含Xanthobacteraceae，Curculionidae富含Morganellaceae。随机森林模型使用全部甲虫内部微生物组预测甲虫科时，OOB误差为26.0%；分开建模后误差增加（对照组27.3%，漂白组36.6%）。重要分类群包括Erysipelotrichaceae（Carabidae）、Planococcaceae（Chrysomelidae、Scarabaeidae、Silphidae）、Morganellaceae（Curculionidae、Trogidae）以及Wohlfahrtiimonadaceae和Planococcaceae（Staphylinidae）。
3.6 微生物群落相似性：对照组中，甲虫内部、土壤和尸体微生物组共有91个共享细菌科（占总观察科数的17%）；漂白组同样有91个共享科（17%）。土壤中特有科数较多，甲虫次之，尸体最少。多个重要分类群（如Planococcaceae、Vagococcaceae、Wohlfahrtiimonadaceae）在三种样本类型中重叠，反映出微生物在尸体、土壤和昆虫间的传递。
讨论部分指出，漂白剂浸泡并未显著改变尸体和土壤的微生物演替，也未显著影响甲虫群落多样性或总数，仅轻微延迟丽蝇产卵。这暗示尸体内部微生物组可能未被表面漂白处理完全灭活，仍能产生吸引昆虫的VOCs。同时，甲虫内部微生物主要受昆虫自身科属和采集时间驱动，与尸体处理无关。随机森林模型利用土壤微生物组预测放置时间（TOP）具有较高准确率，且漂白处理未降低模型效能，表明在涉及漂白剂掩盖的案件中，微生物组仍可用于时间估计。研究还发现，Wohlfahrtiimonadaceae与丽蝇幼虫活动密切相关，可能通过捕食丽蝇幼虫的甲虫（如Staphylinidae）进入其内部微生物组。局限包括尸体冷冻时间未知、样本量有限、漂白剂浓度单一以及环境因素（如降雨）的潜在影响。未来需研究不同化学物质、浓度和施用方式对内部微生物组和昆虫吸引的影响，以增强法医微生物学的实际应用价值。
