综述：糖原贮积症的基因组编辑

《Journal of Inherited Metabolic Disease》：Genome Editing for Glycogen Storage Diseases

　　

针对多种糖原贮积症的基因治疗已被开发并推进至临床试验（clinical trials）。然而，这些基因疗法在生命早期治疗后稳定性方面的局限性，促使了基因组编辑（genome editing）的发展。在糖原贮积症Ia型（glycogen storage disease type Ia, GSD Ia）和庞贝病（Pompe disease）中，基因组编辑的早期结果已显示出令人鼓舞的疗效，概念验证研究（proof-of-concept studies）以及一项临床试验正在开展中。这些研究将确定基因组编辑是否能够实现其在生命早期稳定治疗糖原贮积症的潜力。

1 Potential for Genome Editing to Address the Limitations of Gene Therapy
基因组编辑技术可在染色体DNA层面引入可遗传的改变，从而克服基因治疗的主要局限性。当前基因治疗多采用腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体递送治疗性转基因，但AAV载体基因组以游离体（episome）形式存在，随细胞分裂而丢失，尤其影响婴幼儿早期治疗；同时，病毒增强子驱动的异位表达可能诱发免疫反应，高剂量AAV还可导致T细胞应答、补体激活及血栓性微血管病。基因组编辑通过同源定向修复（homology-directed repair, HDR）或碱基/先导编辑实现定点整合或变异校正，可利用内源启动子避免异位表达，但编辑工具的递送仍常依赖AAV，且肌肉组织中HDR效率较低，而肝脏因高效的HDR和载体摄取能力更适合基因组编辑。

2 Status of Clinical Development of Gene Therapy for Glycogen Storage Diseases
目前GSD Ia仅能依靠膳食疗法（生玉米淀粉补充）控制症状，虽延长寿命，但无法阻止肝细胞癌和终末期肾病等远期并发症。AAV介导的基因治疗在临床前模型中可暂时纠正葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G6Pase）缺乏，但肝内AAV游离体基因组丰度随时间显著下降，导致疗效短暂。已批准的GSD Ia基因治疗临床试验仅纳入青少年和成人，排除了小于8岁的患者。即便采用高剂量载体或再给药策略，基因治疗仍不能完全逆转病变，例如新生G6pc^?/?小鼠中自噬抑制仅被部分恢复。庞贝病的肝靶向基因治疗同样存在局限性，相关策略已进入成人迟发型患者的临床试验。

3 Overview of Genome Editing
现代基因组编辑策略主要分为两类：一是利用靶向核酸酶或重组酶在特定位点插入转基因，二是利用靶向DNA修饰酶精确改变基因组位点。根据适用人群，策略可分为“通用型”（不依赖患者具体变异）和“个性化”（针对特定变异）。递送方式多采用AAV编码的转基因和供体模板，或脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）包裹的信使RNA（mRNA）。转基因插入时，若无需严格控制表达或不存在显性负效等位基因，常选用安全港位点（如AAVS1、白蛋白位点）；否则应靶向内源基因位点以利用其顺式调控元件。技术层面，锌指核酸酶（zinc-finger nuclease, ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）曾用于诱导双链断裂（double-strand break, DSB），但CRISPR/Cas系统因其可编程性和简便性而成为主流。重组酶介导的插入虽可提高整合效率，但靶位点限制较大。混合策略将sgRNA和供体模板置于AAV中，而编辑酶以LNP-mRNA形式递送，可限制编辑酶表达时间并避免其基因组整合。个性化编辑包括基于HDR的短供体校正、碱基编辑（base editing）和先导编辑（prime editing），其中先导编辑灵活性更高，可进行多核苷酸替换、缺失和短插入，但设计复杂且编辑效率与编辑复杂度相关；碱基编辑效率较高，但受编辑窗口和PAM位点限制。

4 Overview of Genome Editing Safety
临床应用前必须全面评估核酸酶诱导的基因毒性。除常规的计算机模拟脱靶预测外，还应采用无偏倚方法如CHANGE-seq和GUIDE-seq鉴定全基因组脱靶位点；若编辑方法产生DSB，建议使用长读长基因组测序检测大片段缺失或染色体重排。腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor, CBE）仅产生单链切口，降低DSB相关风险，但仍可能发生脱靶碱基编辑或非引导RNA依赖的脱氨事件。编辑酶的表达持续时间是关键因素，AAV载体的长期表达可能增加脱靶频率并触发细胞毒性T细胞清除被编辑细胞。关于LNP-mRNA递送平台，临床数据显示主要不良事件为短暂转氨酶升高和输注相关反应；Intellia Therapeutics的NTLA-2001和NTLA-2002、Verve Therapeutics的VERVE-101/102以及Beam Therapeutics的BEAM-302均报告了各自的安全性和耐受性数据，但BEAM-301在GSD Ia中的安全性数据尚未公布。

5 Genome Editing for GSD Ia by HDR-Mediated Transgene Insertion
针对GSD Ia的HDR介导转基因插入已在多种模型中验证。研究人员利用ZFN介导的基因组编辑在G6pc^?/?小鼠中显示出优于基因替代疗法的效果；同时，加入苯扎贝特（bezafibrate）诱导自噬可进一步增强肝脏病变的校正。犬模型中，采用双AAV载体递送金黄色葡萄球菌Cas9（Staphylococcus aureus Cas9）和供体模板，将功能性G6PC cDNA整合至内源G6PC启动子下游，在成年犬和幼犬中均实现了0.5%–1%的肝内基因整合，且长期随访证实编辑稳定。新生小鼠模型中，采用化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9）并联合高剂量载体和苯扎贝特治疗，达到8%的正常G6Pase活性（超过预防肝细胞癌所需的3%阈值），肝内整合效率最高可达6%，显著高于无苯扎贝特时约1%的效率；苯扎贝特通过增加肝细胞转导和刺激自噬发挥多重益处。

6 Personalized Genome Editing for GSD Ia
针对GSD Ia中约33%高加索患者携带的常见致病变异p.R83C（c.247C>T），研究人员构建了人源化小鼠模型。早期CRISPR-Cas9 HDR校正仅达到0.7%的等位基因校正率，但小鼠无低血糖性癫痫，肝脏G6Pase活性超过3%，并能耐受24小时禁食。基于NHEJ的双链寡核苷酸插入策略在2周和4周龄两次给药后，所有纯合小鼠存活，肝内G6Pase活性约为正常的4%，变异校正率为0.1%–1.4%。采用LNP递送的ABE技术对p.R83C进行校正，在新生小鼠中最高可达60%的肝脏校正率（均值30%），但长期随访显示校正率波动较大（<1%–37%），新生期治疗的小鼠肝脏G6Pase活性约达正常的40%，3周龄治疗者约为25%。尽管停食后血糖在8周时正常，但53周时仍偏低；肾脏增大现象在治疗组中有所减轻。该ABE策略已进入1/2期临床试验（NCT06735755）。

7 Genome Editing for Pompe Disease
腺嘌呤碱基编辑已应用于3种导致婴儿型庞贝病（infantile-onset Pompe disease, IOPD）的无义变异（c.2227C>T/p.Gln743Ter、c.2560C>T/p.Arg854Ter、c.2608C>T/p.Arg870Ter）。体外实验中，ABEmax核转染患者的真皮成纤维细胞后，目标校正率分别为50%、41%和74%，编辑后细胞GAA酶活性接近野生型，溶酶体负担（以LAMP2蛋白为指标）降低。体内研究中，采用分裂内含子（split intein）双AAV载体递送ABE治疗携带c.2227C>T变异的小鼠，可降低心肌和骨骼肌的糖原含量。庞贝病的个性化编辑（碱基或先导编辑）具有巨大潜力，但肌肉靶向递送需要极高载体剂量并伴随毒性风险。尽管GAA基因c.-32-13C>T（IVS1）变异见于约90%美国庞贝病患者，但该位点尚未能进行碱基或先导编辑，可能与其附近的DNA修饰有关。

8 Potential of Other Glycogen Storage Diseases for Genome Editing
糖原贮积症对基因组编辑的潜在反应性主要取决于受累器官和致病变异的特征。常见高频变异的存在有利于采用碱基或先导编辑进行个性化治疗。目前肝靶向编辑（如GSD Ia）进展明显快于肌肉靶向编辑（如庞贝病）。因此，仅累及肝脏的糖原贮积症类型（如GSD 0a、Ib、VI及部分IX型）更适于基因组编辑，而累及肌肉和心脏的类型（如GSD 0b、III、IV、V、VII及部分IX型）则难度较大。累及神经系统的类型（Lafora病、婴儿型庞贝病）因递送及脑中编辑的技术挑战而尤为困难，但Lafora病可能因神经元不分裂而对AAV基因治疗敏感。GSD Ia的肾脏受累在基因治疗中难以纠正，这一障碍也影响基因组编辑在肾脏病变中的进展。

9 Summary/Conclusions
随着基因治疗在生命早期治疗稳定性方面的局限性日益明确，基因组编辑已被视为实现持久疗效的替代策略。在糖原贮积症领域，特别是GSD Ia和庞贝病中，转基因插入和靶向校正的临床前研究正在推进。CRISPR介导的体细胞编辑可通过改变sgRNA适应多种致病变异，加上美国FDA对核酸类药物平台技术的认可，有望为这些及其他经典遗传代谢病提供根治性疗法。