肠道感染在大脑和脑膜中建立抗原特异性的长寿命记忆CD4+ T细胞

《Nature Neuroscience》：Intestinal infections establish antigen-specific, long-lived memory CD4+ T cells in the brain and meninges

　　

脑膜构成大脑与外周之间的边界，并富含丰富的免疫细胞网络。研究人员发现，胃肠道刺激（胞内或胞外细菌及寄生虫）会重塑硬脑膜（最外层脑膜）中CD4⁺ T细胞的性质，将其主导极化状态分别转变为T辅助（T helper, TH）1、TH17和TH2细胞，并伴随不同的细胞因子谱。这一过程通过依赖CXCR6–CXCL16的肠道活化CD4⁺ T细胞向中枢神经系统的迁移实现，这些细胞在硬脑膜静脉窦周围、硬脑膜淋巴聚集体内以及大脑中建立长寿命的记忆群体。功能上，这些经口驯化的硬脑膜CD4⁺ T细胞能够在静脉再激发时迅速产生抗原特异性回忆反应，增殖并产生细胞因子。研究结果揭示了肠道与硬脑膜免疫之间的直接联系，使中枢神经系统边界能够获得对肠道微生物的免疫记忆，而肠道微生物是能够通过有窗孔的硬脑膜血管系统到达大脑的血源性病原体的主要来源。

脑膜是覆盖大脑和脊髓的边界组织，由外层硬脑膜、中层蛛网膜和内层软脑膜构成。硬脑膜内含有静脉窦，其血管内皮存在窗孔，使得血源性微生物有可能进入中枢神经系统（central nervous system, CNS）。硬脑膜中聚集了多种免疫细胞，包括围绕静脉窦的细胞群体和硬脑膜相关淋巴组织（dura-associated lymphoid tissue, DALT）中的淋巴细胞。先前研究表明，肠道来源的IgA浆细胞可定位于硬脑膜静脉窦壁，参与抵御血源性病原体。然而，肠道这种远端器官的免疫刺激是否会改变硬脑膜CD4⁺ T细胞的性质，此前尚不清楚。肠道炎症与中枢神经系统病理相关，例如炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）患者焦虑和抑郁风险增加；CD4⁺ T细胞来源的细胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17）已被证明可影响脑功能。因此，研究人员提出假设：肠道感染激活并极化的CD4⁺ T细胞可能迁移至硬脑膜，从而塑造脑边界的适应性免疫。

研究人员利用多种肠道感染小鼠模型，包括葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate, DSS）诱导的结肠炎、柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）口服感染、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）口服感染、曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）感染及毛首鞭虫（Trichuris muris）感染，结合流式细胞术、T细胞受体（T cell receptor, TCR）测序、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、混合骨髓嵌合体、抗体中和及共聚焦显微镜等技术，系统分析了肠道和硬脑膜CD4⁺ T细胞的变化。研究发现，肠道感染能重塑硬脑膜CD4⁺ T细胞的极化状态，使其与肠道中的T辅助（T helper, TH）细胞亚型一致，且这种重塑依赖于CXCR6–CXCL16介导的细胞迁移。这些迁移至硬脑膜的肠道活化CD4⁺ T细胞具有长寿命记忆表型，并能对静脉再激发产生快速的抗原特异性回忆反应，同时可降低血源性病原体向大脑的扩散。该研究发表于《Nature Neuroscience》，揭示了肠道与硬脑膜免疫之间的直接联系，为理解中枢神经系统边界如何获得针对肠道微生物的免疫记忆提供了新机制。

**主要技术方法**

研究使用了C57BL/6J小鼠（购自Jackson Laboratories或内部繁殖），部分实验使用TO或BALB/C小鼠（曼氏血吸虫感染）。主要方法包括：DSS诱导结肠炎及口服细菌/寄生虫感染模型；流式细胞术检测细胞极化和细胞因子；TCR测序分析克隆共享；单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序分析细胞亚群；混合骨髓嵌合体评估趋化因子受体功能；中和抗体阻断CXCL16；全组织共聚焦显微镜观察细胞定位；静脉再激发模型评估记忆和脑部保护作用；病原体载量（colony-forming units, CFU）测定。

**研究结果**

**肠道挑战塑造硬脑膜CD4⁺ T细胞的极化和细胞因子谱**

通过DSS诱导结肠炎和口服柠檬酸杆菌感染（二者均诱导肠道TH17细胞），研究人员在硬脑膜血管外组织中也观察到RORγt⁺ TH17细胞显著增加，而脾脏中无明显变化。口服曼氏血吸虫（诱导TH2）导致硬脑膜GATA-3⁺ TH2细胞扩张；口服毛首鞭虫（诱导TH1）则增加T-bet⁺ TH1细胞。结果表明，肠道感染类型决定硬脑膜CD4⁺ T细胞的极化方向，且伴随不同的细胞因子谱。

**肠道挑战导致抗原特异性CD4⁺ T细胞在硬脑膜积累**

TCR测序显示，DSS结肠炎小鼠硬脑膜与十二指肠和远端结肠之间共享TCR克隆比例显著升高。口服表达2w1s抗原肽的减毒鼠伤寒沙门氏菌后，在硬脑膜和结肠的血管外组织中检测到2w1s四聚体阳性的CD4⁺ T细胞，这些细胞表达CD44和CD69，并分泌IFN-γ。表明肠道活化的抗原特异性CD4⁺ T细胞可迁移至硬脑膜，形成组织记忆群体。

**肠道CD4⁺ T细胞向硬脑膜迁移依赖于Cxcr6–Cxcl16相互作用**

对已发表的肠道CD4⁺ T细胞scRNA-seq数据分析显示，Cxcr6是肠道CD4⁺ T细胞中表达最高的趋化因子受体。硬脑膜中其配体Cxcl16主要由巨噬细胞表达。中和CXCL16抗体可减少口服沙门氏菌后硬脑膜中抗原特异性CD4⁺ T细胞的数量，而混合骨髓嵌合体实验中Cxcr6缺陷细胞向硬脑膜的募集显著弱于野生型细胞。证实CXCR6–CXCL16轴在肠道CD4⁺ T细胞向硬脑膜迁移中发挥关键作用。

**肠道挑战产生长寿命硬脑膜抗原特异性记忆CD4⁺ T细胞，可对静脉再激发产生回忆反应**

口服2w1s-沙门氏菌5.5周后进行静脉再激发，硬脑膜中2w1s特异性CD4⁺ T细胞数量显著增加；该回忆反应在初次口服感染后5个月仍可观察到。scRNA-seq分析鉴定出表达Ifng的CD4⁺ T细胞簇，这些细胞高表达组织驻留标志和整合素VLA4（integrin alpha 4/beta 1）。离体再刺激实验证实，硬脑膜中的肠道预致敏CD4⁺ T细胞能在抗原刺激下上调Nur-77并分泌IFN-γ，表明其具有真正的抗原特异性回忆能力。

**口服预免疫诱导硬脑膜和大脑抗原特异性CD4⁺ T细胞，并防止静脉细菌扩散入脑**

口服2w1s-沙门氏菌预免疫后，静脉再激发野生型沙门氏菌，硬脑膜中2w1s特异性CD4⁺ T细胞扩张，且脑内细菌载量显著降低，该保护不受再激发阶段CXCL16阻断影响，提示局部硬脑膜记忆细胞而非新迁移细胞起作用。进一步采用仅共享单一CD