ATP介导的人NLRP6炎症小体抑制的结构机制

《Nature Structural & Molecular Biology》：Structural mechanisms for ATP-mediated inhibition of human NLRP6 inflammasome

　　

炎症小体主要通过由核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domain, NBD）和富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat, LRR）构成的NLR家族蛋白作为传感器，针对感染性病原体和非感染性危险信号激发先天免疫防御。NLRP6是一种炎症小体传感器，在调节肠道炎症中发挥关键作用，其过度激活与炎症性肠病等自身炎症疾病相关。然而，NLRP6如何维持抑制性结构尚不清楚。研究人员报道了人NLRP6单体在腺苷-5′-三磷酸（adenosine-5′-triphosphate, ATP）/NBD结合（扭曲构象）和未结合（延伸构象）两种状态下的冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）结构。ATP结合事件连接并压缩NACHT亚结构域和LRR结构域，从而将NLRP6维持在抑制性构象。NBD直接与螺旋结构域1（helical domain 1, HD1）、翼螺旋结构域（winged-helix domain, WHD）和螺旋结构域2（HD2）相互作用，进一步促进自身抑制。在细胞研究中，破坏ATP结合和NBD相互作用会解除NLRP6炎症小体的抑制。扭曲构象与延伸构象的结构比较揭示，NLRP6特异性酸性环的重排调节NLRP6活性。尽管NLRP6的ATP结合与NLRP3的强效抑制剂MCC950结合NLRP3在结构中共享相似的相互作用位置，但MCC950在细胞中并不抑制NLRP6。综上所述，这些数据揭示了ATP介导的NLRP6协同抑制机制，并为NLRP6相关自身炎症疾病的治疗干预提供了见解。

ATP介导的人NLRP6炎症小体抑制的结构机制——论文解读

炎症小体是细胞质内的多蛋白复合物，通过激活caspase-1促进IL-1β/IL-18成熟和gasdermin D介导的细胞焦亡，在先天免疫防御中发挥核心作用。NLRP6是一种主要在肠道和肝脏表达的NLR家族蛋白，参与调节肠道炎症、抗菌肽分泌和黏液分泌，其过度激活与炎症性肠病等自身炎症疾病密切相关。然而，NLRP6如何维持抑制状态的结构机制一直未知，阻碍了靶向该传感器的治疗策略开发。针对这一问题，研究人员开展了本研究。

研究人员利用冷冻电镜技术解析了人NLRP6单体在ATP/NBD结合（扭曲构象）和未结合（延伸构象）两种状态的高分辨率结构，揭示了ATP介导的NLRP6自抑制机制。研究发现，ATP以非经典方式结合在NBD、HD1、WHD、HD2和LRR结构域形成的口袋中，作为“分子胶水”将各结构域连接压缩，使NLRP6处于紧凑的抑制构象。NBD通过与WHD、HD1和HD2的直接静电相互作用进一步稳定抑制状态。破坏ATP结合或NBD相互作用可解除抑制，促进NLRP6寡聚化和炎症小体激活。结构比较还发现，NLRP6特有的酸性环在两种构象间发生显著重排，参与调控NLRP6活性。尽管NLRP6的ATP结合位点与NLRP3抑制剂MCC950的结合位点相似，但MCC950并不能抑制NLRP6，提示该口袋具有小分子选择性。该研究揭示了ATP介导的NLRP6协同抑制机制，为NLRP6相关自身炎症疾病的治疗干预提供了重要理论基础。论文发表在《Nature Structural 》上。

在技术方法上，研究人员采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达人NLRP6（14–892）蛋白，通过Ni-NTA亲和纯化和两次凝胶过滤层析获得单体蛋白；利用Titan Krios冷冻电镜收集数据，用cryoSPARC进行单颗粒三维重构，分别获得3.7 ?和3.8 ?分辨率的两种构象结构；通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证蛋白样品中内源性ATP的存在；利用孔雀绿磷酸盐检测法测定ATP酶活性；并在HEK-293T细胞中重建NLRP6炎症小体，通过检测caspase-1 p20片段评估NLRP6激活程度。该研究未涉及临床样本队列。

**两种构象状态下人NLRP6的结构解析（Structure determination of human NLRP6 under two conformational states）**

研究人员通过冷冻电镜数据二维分类发现两种主要构象。三维重建后得到扭曲构象（3.7 ?）和延伸构象（3.8 ?）。在扭曲构象中，NBD、HD1、WHD、HD2和LRR结构域被解析，并发现一个明确的ATP密度位于各结构域之间的裂缝中。LC-MS确认该ATP为内源性结合。延伸构象中NBD和PYD缺失，但酸性环与LRR结构域形成广泛相互作用。两种构象的差异表明ATP和NBD的存在使NLRP6呈现紧凑的抑制构象。

**ATP限制NLRP6炎症小体活性（ATP restricts the activity of NLRP6 inflammasome）**

ATP酶活性测定显示，单体NLRP6具有低基础ATP水解活性，而寡聚NLRP6活性显著升高。Walker A/B基序突变并未降低单体ATP酶活性，而新发现的ATP结合口袋突变（如H539L、Y623A）显著增强ATP水解并促进寡聚化。在HEK-293T细胞重建实验中，这些突变强烈诱导caspase-1剪切（p20产生），说明ATP结合通过稳定抑制构象来限制NLRP6炎症小体激活。

**NBD直接参与NLRP6的抑制（NBD contributes to the inhibition of NLRP6 inflammasome）**

结构比对显示，NLRP6的NBD采用不同于NLRP3、NLRC4和NLRP1的独特构象，与WHD、HD1和HD2形成多个静电相互作用界面。突变关键界面残基如K213A/K214A、E242A、K483A、Q496A（NBD-WHD界面），R333A、R347A、D351A（NBD-HD1界面），R306A（NBD-HD2界面）均显著增强caspase-1剪切，表明NBD通过直接相互作用维持NLRP6的自抑制状态。

**酸性环的重排调节NLRP6炎症小体（Repositioning of the acidic loop modulates the NLRP6 inflammasome）**

在扭曲构象中，酸性环（E609–N616）较短，通过氢键网络稳定ATP结合，并连接HD2和LRR。在延伸构象中，酸性环（T594–N616）较长，与LRR结构域上的碱性残基形成电荷互补相互作用。突变酸性环上的谷氨酸残基（E611A、E613A、N616A）或LRR上的精氨酸残基（R648A/R650A、R678A）均影响caspase-1剪切，表明酸性环的构象转换是调节NLRP6活性的关键开关。

最后，在讨论部分，研究人员提出“ATP调节的ATP水解与NLRP6炎症小体激活”模型：在稳态下，高浓度ATP结合抑制性口袋，阻止NLRP6自激活；病原或损伤信号导致ATP水平下降时，抑制解除，NLRP6在经典催化位点水解ATP，进一步促进激活，形成正反馈。该模型与SARM1的NAD+调节机制相似。NLRP6 NBD的独特构象可能通过位阻阻止底物ATP进入经典催化位点，而酸性环的柔性在构象转换中起关键作用。研究人员也承认HEK-293T过表达系统的局限性，未来将在原代肠上皮细胞中通过CRISPR-Cas9敲入突变验证生理相关性。研究结论部分翻译如下：作为胃肠道系统中的主要炎症小体传感器，NLRP6在调节肠道炎症中发挥关键作用，其过度激活与炎症性肠病密切相关。研究人员对ATP介导的人NLRP6抑制的结构发现，为设计靶向慢性炎症性疾病的治疗药物提供了重要见解。