《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Receptor-defined targeting of a genomically unique melanoma-enriched noncanonical antigen
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摘要翻译：有效的基于T细胞的免疫疗法需要功能性受体，这些受体可以被工程化并重新部署以识别肿瘤限制性抗原。由注释蛋白编码区之外转录产生的非经典肽拓展了癌症的抗原景观；然而，系统性地对这类靶标进行生物学优先排序和功能验证的策略仍不成熟。本研究整合了de novo转
摘要翻译：有效的基于T细胞的免疫疗法需要功能性受体，这些受体可以被工程化并重新部署以识别肿瘤限制性抗原。由注释蛋白编码区之外转录产生的非经典肽拓展了癌症的抗原景观；然而，系统性地对这类靶标进行生物学优先排序和功能验证的策略仍不成熟。本研究整合了de novo转录本分析、外显子分辨率定量、RNA原位杂交和免疫肽组学，以鉴定黑色素瘤相关非经典转录本，并通过受体水平验证推进候选靶标。在三个复发性黑色素瘤相关转录本中，EVA003因其独特的重复序列富集基因组结构、独立数据集中一致的肿瘤富集外显子水平表达以及基因组独特的免疫原性核心序列而成为主要候选靶标。研究人员证明了EVA003衍生肽段在HLA-A*03:01上的内源呈递，并在患者来源的肿瘤浸润淋巴细胞中检测到特异性反应。单细胞转录组谱分析鉴定出一个主导性的肽反应性克隆型，从而能够分离出一种天然存在的T细胞受体。将该受体转入健康供者T细胞后，赋予了抗原依赖性激活及对肽脉冲靶细胞和内源性表达EVA003的黑色素瘤细胞的细胞毒性。总之，这些发现建立了一种基于生物学信息的非经典肿瘤抗原优先排序策略，并证明基因组独特、肿瘤富集的非经典肽可以被呈递给分子定义的受体，从而介导癌细胞杀伤。这些发现支持将优先排序的非经典抗原整合到工程化T细胞治疗策略中。
论文解读：非经典抗原从转录组发现走向受体定义的T细胞靶向治疗
研究背景与问题：近年来，基于T细胞的免疫疗法虽在肿瘤治疗中取得突破，但其疗效高度依赖于肿瘤限制性抗原的鉴定。免疫检查点阻断和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）过继转移虽然能够诱导持久应答，却受制于内源性免疫异质性和患者特异性抗原库。工程化策略如嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）和T细胞受体（T cell receptor，TCR）疗法虽能提供更强的特异性控制，但高度肿瘤选择性靶标的匮乏以及靶向非肿瘤组织的毒性风险仍限制其广泛应用。突变来源的新抗原虽具有肿瘤特异性，但多数为患者私有，难以规模化推广。非经典肽（noncanonical peptides，NCPs）源于注释蛋白编码区之外的转录本翻译，包括长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）逆转录元件、内源性逆转录病毒及其他非编码基因组位点。在正常组织中这些区域通常被表观遗传沉默，而癌症中广泛的表观遗传失调可激活隐性转录程序，产生并呈递MHC I类分子上的新肽段。由于NCPs源自种系基因组区域而非体细胞突变，因此有潜力在肿瘤间共享，同时在健康组织中基本不表达。然而，随着候选NCPs数量激增，关键挑战已从发现转向优先排序：大多数NCPs缺乏肿瘤特异性、内源呈递、免疫识别和功能可操作性方面的系统性验证。非经典转录本能否从基因组候选推进到受体定义的工程化靶标仍是未知数。
研究内容与结论：研究人员整合了de novo转录本组装、外显子分辨率肿瘤/正常组织定量、RNA原位杂交、免疫肽组学和单细胞TCR谱分析，对黑色素瘤相关非经典转录本进行生物学优先排序，并将选定的候选靶标推进至受体水平定义。在三个复发性转录本中，EVA003因其重复序列富集的基因组结构、跨独立数据集一致的肿瘤富集外显子表达、在正常组织中不表达、内源HLA I类呈递以及患者来源TILs中的可检测反应性而成为最具生物学特色的候选分子。EVA003衍生肽LLMRPLRIK（LLM）和VLLMRPLRIK（VLL）在HLA-A*03:01上内源呈递，并被患者TILs特异性识别。单细胞转录组分析鉴定出一个主导性反应克隆型NCP-TCR1，将其克隆至慢病毒载体并转入健康供者T细胞后，赋予了抗原依赖性细胞因子释放和细胞毒性。在共培养实验中，NCP-TCR-T细胞能够特异性杀伤内源表达EVA003的黑色素瘤细胞系MM-21，而对EVA003低表达的MM-22及非恶性肺成纤维细胞CCL-210和人结肠平滑肌细胞HCoSMC无明显反应。该研究证实了一个基因组独特的肿瘤富集非经典肽能够被呈递给分子定义的受体并介导癌细胞杀伤，为非经典抗原纳入工程化T细胞治疗策略提供了生物学依据。论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
主要关键技术方法：研究人员使用了多项核心技术：基于de novo转录组组装的非经典转录本鉴定及剪接比对；利用Salmon进行外显子分辨率表达定量以区分肿瘤与正常组织；RNAscope?原位杂交验证组织水平表达；免疫肽组学结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）确认HLA呈递肽段；NetMHCpan-4.1进行HLA结合预测及APE-Gen结构建模；通过IFNγ ELISpot筛选TIL反应性；利用10x Genomics单细胞转录组和免疫谱分析解析TCR克隆型；通过慢病毒转导进行TCR功能验证；采用细胞内因子染色、铬-51释放实验和xCELLigence实时阻抗杀伤实验评估效应功能。样本队列来源于丹麦哥本哈根大学医院Herlev医院国家癌症免疫治疗中心（CCIT-DK）三项临床试验的23例转移性黑色素瘤患者的肿瘤和TIL标本。
研究结果：
1. 黑色素瘤相关非经典转录本的鉴定与基因组优先排序：通过de novo组装从黑色素瘤转录组中确定三个复发性候选转录本EVA001、EVA002和EVA003。剪接比对至人参考基因组（hg38）确认了各自的染色体定位、链方向和外显子-内含子结构。重复序列注释显示EVA003含有丰富的散在重复序列，包括简单重复、SINE、LINE和ERVL-MaLR亚类LTR元件，而EVA001和EVA002缺乏可识别的重复元件。外显子水平定量显示EVA003在10例黑色素瘤和10例正常组织样本间实现完全分离（Cliff’s δ=1.0，p<0.00018），而EVA001和EVA002存在部分重叠。RNAscope?验证了EVA003在黑色素瘤活检组织中的表达，而在肺、肝、结肠和皮肤正常活检中未检测到。
2. EVA003在黑色素瘤中具有稳健表达并产生HLA-A*03:01呈递的NCPs，引发内源性TIL反应：在23例转移性黑色素瘤肿瘤中，16例（69.5%）至少表达一个EVA转录本，EVA003最为普遍。EVA001和EVA002仅在与EVA003共表达的肿瘤中出现。纵向配对活检分析显示EVA转录本在后期时间点表达降低。IFNγ ELISpot筛选在两位患者（MM-01和MM-21）的TILs中检测到EVA003肽库特异性反应。肽段解卷积鉴定出共享序列VLLMRPLRIK的重叠肽段，最小表位测试证实9聚体LLMRPLRIK（LLM）和10聚体VLLMRPLRIK（VLL）均能诱导IFNγ应答。NetMHCpan-4.1预测两种肽段均为HLA-A03:01强结合物（%Rank 0.08，预测亲和力约20 nM）。免疫肽组学确证了EVA003转染的CaSki细胞中两种肽段在HLA-A03:01上的内源呈递。LLM编码的27-nt序列在hg38全基因组扫描中仅存在单一精确匹配，对应EVA003位点，允许至多两个错配时也未检测到其他位点。包含该免疫原性核心的600-nt区域在10例黑色素瘤样本中表达（中位TPM=4.0），而10例正常组织中表达可忽略（中位TPM=0），Cliff’s δ=1.0，p=0.00013。
3. 非经典肽识别由主导性、分子定义的T细胞受体介导：对MM-01患者LLM刺激的TILs进行功能富集及单细胞RNA测序，鉴定出一个IFNG高表达的优势TCR克隆型，命名为NCP-TCR1。将NCP-TCR1的α和β链克隆至慢病毒载体并转导健康供者T细胞，获得高纯度NCP-TCR-T细胞。细胞内因子染色显示CD8+ NCP-TCR-T细胞在LLM或VLL肽脉冲的T2-A3细胞刺激下共表达IFNγ、TNF和CD137，激活水平显著高于非转导T细胞（NTDs），且无肽时无激活。铬-51释放实验表明CD8+ NCP-TCR-T细胞对肽脉冲靶标的杀伤呈效应器-靶标比依赖性，LLM脉冲靶标的裂解效率略高于VLL，非脉冲靶标和NTD对照裂解极低（p<0.0001）。
4. 内源性EVA003表达使黑色素瘤细胞易受NCP-TCR1介导的特异性识别：HLA-A03:01阳性患者来源黑色素瘤细胞系MM-21高表达EVA003（RNAscope?验证），免疫肽组学确认LLM和VLL肽段在MM-21细胞中内源呈递。NCP-TCR-T细胞与MM-21共培养后表现出显著激活（p=0.0079），显著高于对EVA003低表达MM-22的反应。对非恶性CCL-210肺成纤维细胞和HCoSMC结肠平滑肌细胞未见多因子CD8+ T细胞反应增加。xCELLigence实时杀伤实验显示NCP-TCR-T细胞与MM-21共培养时细胞指数曲线下面积显著降低（p=0.0022），而在EVA003低表达HLA-A03:01阳性黑色素瘤细胞系中无显著差异，证实抗原依赖性细胞毒性。
讨论总结与研究结论：研究人员指出非经典肽显著扩展了癌症抗原景观，但瓶颈已从发现转向生物学优先排序。EVA003代表了共享型、非突变型细胞内抗原的原型，可经由受体工程化靶向。其重复序列富集结构（含ERVL-MaLR LTR元件）及与黑色素瘤进展相关的长链非编码RNA LINC00518邻近性提示其表达是表观遗传失调的免疫学可利用副产物。TIL反应性在HLA-A03:01阳性亚组中并不普遍，可能反映抗原丰度及TIL体外扩增局限。LLM较VLL更强的功能反应并非由肽段丰度或预测结合亲和力决定，APE-Gen建模提示肽段构象差异（VLL 10聚体中央主链隆起）影响TCR接触面。体外肽脉冲实验的反应幅度高于内源表达肿瘤细胞，符合生理性抗原密度。NCP表达具有动态性，纵向分析显示后期表达降低，可能反映免疫介导的选择或肿瘤演化，提示NCPs可能面临抗原丢失逃逸。研究人员强调非经典抗原在合成T细胞回路设计中可作为条件性共激活输入，而非单独激活触发器。安全性评估需扩展GTEx等正常组织表达谱及模拟表位交叉反应筛选。该研究证明了黑色素瘤相关非经典转录本可被系统性优先排序、解析至天然TCR克隆型并重新部署为能够介导抗原依赖性肿瘤细胞杀伤的工程化受体。
核心结论：该研究建立了一条从转录组发现到受体定义靶标的非经典抗原推进路径，证实基因组独特、肿瘤富集的非经典肽可以被呈递给分子定义的TCR，并通过受体转移赋予T细胞抗原特异性杀伤功能，支持将优先排序的非经典抗原整合至下一代T细胞工程策略中。
