超嗜热古菌中N2固定的分子基础

《Nature Communications》：Molecular basis of N2 fixation in a hyperthermophilic archaeon

　　

探索系统发育上远缘的固氮酶的自然多样性，对于获得对大气N₂固定机制的新认识以及解锁可持续氨生产中的生物技术发展至关重要。在此，研究人员研究了深海超嗜热古菌Methanocaldococcus infernus的N₂固定系统，该古菌在92°C下以固氮方式生长。这种天然分离的固氮酶具有接近水沸点的熔化温度，其外推的比活性优于中温同源物。以近原子分辨率获得的晶体结构呈现出已知最简单的固氮酶，其包含用于热稳定性的策略性热点。它结合了所有三种已知固氮酶同工型的结构特征，强化了祖先固氮酶比细菌同源物更类似于古菌酶的论点。与结构同源物相比，电子传递金属辅因子“P-cluster”被捕获在一种等待电子传递的稀有状态，提供了生理状态的详细图景。活性位点含有FeMo-cofactor催化剂，表现出静息态和“周转”态的混合物，此前仅在细菌钒固氮酶和只含铁固氮酶中描述过。因此，这些结果统一了所有固氮酶的机制原理，并强调了古菌酶超热稳定性的优势，为进一步理解自然界如何断裂N₂三重键开辟了新途径。

**超嗜热古菌固氮酶的分子基础解读**

生物固氮是地球上氮循环的关键环节，由固氮微生物完成，为生物圈提供近一半的氮素。与需要极端条件（200 bar、400–500°C）且排放大量CO₂的工业Haber-Bosch过程相比，生物固氮在常温常压下即可将大气N₂转化为氨（NH₃），因此开发绿色可持续的氨合成方法需要深入理解固氮酶机制。然而，现有固氮酶研究长期集中于模式菌株Azotobacter vinelandii，其基因组含有大量nif基因，可能掩盖了核心催化原理。探索系统发育上远缘的固氮菌，特别是具有最小nif基因集的微生物，有助于区分保守策略、揭示固氮酶催化的适应性机制。Methanocaldococcus infernus是一种深海超嗜热古菌，能在92°C下固氮生长，其固氮酶系统可能保留祖先固氮酶的特征，为研究固氮机制和开发耐热催化剂提供了独特材料。

研究人员从M. infernus中天然纯化了固氮酶MiNifDK和MiNifH，通过X射线晶体学解析了两种晶型的高分辨率结构（1.37 ?和1.21 ?），结合反常散射确定了金属辅因子组成，并测定了酶的热稳定性和活性。研究发现MiNifDK在已知固氮酶中结构最为简化，但融合了Nif、Vnf和Anf三种同工型的结构特征；其熔化温度高达92.3°C，远优于中温同源物；更重要的是，晶体结构捕获了P-cluster的P1+状态和FeMoco的“turnover”状态，首次在钼固氮酶中观察到此类催化中间态，从而统一了所有固氮酶的机制原理。该成果发表于《Nature Communications》，为理解生物N₂三键断裂机制和设计新型人工固氮催化剂提供了重要基础。

在技术方法上，研究人员使用来自德国微生物保藏中心DSMZ的Methanocaldococcus infernus DSM 11812菌株，在厌氧条件下培养并收获细胞。通过渗透裂解、阴离子交换和疏水相互作用色谱等步骤，从天然细胞中分离出MiNifDK和MiNifH。纯化后的蛋白在厌氧手套箱中利用坐滴气相扩散法结晶，获得单斜和三斜两种晶型。在瑞士光源SLS和欧洲同步辐射装置ESRF收集高分辨率衍射数据，使用AlphaFold2模型进行分子置换，精修至近原子分辨率；利用反常散射差异图确认Mo和Fe位置。同时采用热变性实验和固氮活性测定（ATP再生系统）评估酶的热稳定性和催化性能。

**天然分离的超热稳定固氮酶（Native isolation of a hyperthermostable nitrogenase）**
研究表明，M. infernus在92°C下可进行依赖钼的固氮生长，且对钨酸盐表现出极高耐受性。研究人员从固氮细胞中天然纯化的MiNifDK熔化温度（Tm）为92.3°C，较A. vinelandii的AvNifDK（Tm=60.1°C）高约32°C。在50°C下，MiNifDK的比活性为280 nmol NH₃·min^?1·mg^?1；按阿伦尼乌斯方程外推至80°C可达2240 nmol NH₃·min^?1·mg^?1，超过所有已报道固氮酶。室温下该酶无活性，反映其适应极端环境的刚性与催化柔性间的权衡。

**总体结构特征（General structural features）**
晶体结构显示MiNifDK采用典型的NifD₂K₂四聚体组装。反常散射实验确认FeMoco含钼、P-cluster含铁，并排除第16个Fe位点。MiNifDK结构为已知固氮酶中最简化的，同时包含Nif、Vnf和Anf三种同工型的结构特征。热稳定性主要来自表面多个“热点”区域，通过盐桥/氢键重排和疏水簇增强局部相互作用，其中两个热点位于αIII结构域，该区域参与FeMoco传递和催化。

**电子传递路径（The electron transfer path）**
MiNifDK中P-cluster至FeMoco的电子传递中继与Nif系统一致（Tyr48^K/Ala49^D对），而非Vnf/Anf系统。两种晶型捕获了P-cluster的不同氧化还原状态：A型主要含P2+态（60%），并混合PN态和第二种氧化态；B型主要含P1+态（70%）及一种替代构象。P1+态是极难捕获的稀有状态，代表等待NifH供电子前的生理状态。快速结晶的B型因避免了进一步氧化而保留了这一中间态，为理解电子转移提供了直接结构证据。

**FeMoco位点捕获静息态和“周转”态，凸显固氮酶的共同催化原理（A FeMoco site captured in resting and “turnover” states underscores common catalytic principles of nitrogenases）**
MiNifDK的FeMoco催化腔残基与其他固氮酶高度保守。A型FeMoco呈标准静息态，S2B位于硫皮带、Gln171侧链结合homocitrate；B型则呈现静息态与“turnover”态各50%的混合物。后者以S2B迁移至原Gln171侧链位置、Fe2–Fe6间出现桥连配体、Gln171侧链重排以及水分子桥接为特征，此前仅在钒固氮酶和铁固氮酶中观察到，本次在钼固氮酶中首次发现。桥连配体与Fe6的距离（1.76 ?）暗示可能为含氮物种，但受混合物限制尚无法确定其原子身份。这一发现表明所有固氮酶共享相似的底物活化机制。

在讨论部分，研究人员指出M. infernus的nif操纵子极为精简，仅含四个结构基因和两个调节基因，其天然纯化仅检测到调节蛋白NifI_1,2与NifDK结合，暗示辅助蛋白主要在辅因子合成阶段发挥作用。该古菌对钼的依赖和对钨酸盐的耐受性反映了其适应海底极端环境的金属转运系统。系统发育和结构证据进一步支持Methanococcales的固氮酶可能保留祖先固氮酶特征。MiNifDK的超热稳定性和刚性使得催化中间态可被捕获，为未来通过冷阱和光谱学方法研究固氮机制提供了契机。研究结论认为：这些结果统一了所有固氮酶的机制原理，并强调了古菌酶超热稳定性的优势，为理解自然界如何断裂N₂三键开辟了新途径。