基于小基因的琥珀酸脱氢酶B亚基剪接相关变异特征分析与分类

《npj Precision Oncology》：Minigene-based characterization and classification of splice-associated variants in succinate dehydrogenase B

　　

SDHB中的致病性胚系变异易导致嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，但有限的功能证据给临床解读带来挑战。为研究剪接相关的SDHB变异，研究人员开发了一个跨越外显子2-5的小基因(minigene)，并使用靶向RNA测序评估了HEK293T细胞中衍生的SDHB转录本。研究人员评估了经SpliceAI优先排序的48个变异(Δ≥0.42)、两个阴性对照及内源性SDHB，并将结果与肿瘤数据进行比较(n=2)。19个变异(38%)显示≥90%的野生型剪接，而17个(34%)显示≥90%的异常剪接。在所有变异中，共观察到73个异常转录本(平均每个变异2.3个，22个独特转录本)。利用定制决策框架，为64个异常转录本(88%)分配了基于RNA的证据强度。在26个已分类变异中，10个获得PVS1_Strong(RNA)(38%)，包括8个经典剪接位点变异、1个错义变异和1个终止获得变异；2个获得PVS1_Moderate(RNA)，14个获得BP7_Strong(RNA)。小基因RNA数据的整合使ACMG评分平均变化2.7分，并导致13个变异(50%)的重新分类，其中12个从意义不明确变异(VUS)降级为可能良性，1个从可能致病降级为VUS。这些发现表明，对小基因衍生转录本的靶向测序提供了一种可扩展的方法来评估剪接相关的SDHB变异并改进变异分类。

**论文解读**

**研究背景与目的**

精准肿瘤学中遗传检测的广泛应用旨在识别肿瘤易感基因的致病性变异，但变异的功能分类仍是临床面临的重大挑战。琥珀酸脱氢酶B亚基(SDHB)是SDH复合物(复合物II)的核心组分，独特地连接三羧酸(TCA)循环与电子传递链。SDHB及其他肿瘤抑制基因的杂合致病性功能缺失胚系变异见于24–44%的副神经节瘤或嗜铬细胞瘤(PPGL)患者中，且SDHB相关的遗传性PPGL综合征常与侵袭性病程和不良临床结局相关。然而，ClinVar数据库中约40%的SDHB变异仍被分类为意义不明确的变异(VUS)，严重制约了临床决策。尽管SpliceAI等计算机模拟工具可辅助识别潜在的剪接破坏变异，但这些预测必须通过实验验证。随着基因检测规模不断扩大，亟需可扩展的高通量变异分类策略。小基因(minigene)分析是研究剪接相关变异的一种成熟方法，已成功应用于CHEK2、BRCA1、BRCA2、TP53、MLH1等多种肿瘤抑制基因。本研究旨在建立SDHB小基因系统，对剪接相关变异进行功能性评估并整合至ACMG/AMP分类框架中。

**研究内容与结论**

研究人员构建了涵盖SDHB外显子2-5及其侧翼内含子序列的部分小基因，在HEK293T细胞中系统性评估48个SpliceAI优先排序变异(Δ≥0.42)及2个阴性对照的剪接影响，并通过靶向RNA测序精确鉴定和量化转录本。研究发现19个变异(38%)维持≥90%野生型剪接，17个(34%)显示≥90%异常剪接；整合RNA证据后ACMG评分平均变化2.7分，13个变异(50%)获得临床意义的重新分类。该研究发表于《npj Precision Oncology》，为SDHB剪接相关变异提供了可扩展的分类策略。

**关键技术方法**

研究人员构建了涵盖SDHB外显子2-5的野生型小基因并克隆至pcDNA3.1载体，通过定点突变引入50个单核苷酸变异(SNV)后分别转染HEK293T细胞。采用靶向RT-PCR和Illumina NextSeq 2000测序(每样本≥50,000 reads)，利用STAR算法比对至定制小基因参考序列，通过剪接连接计数量化转录本相对比例。SpliceAI(未掩蔽评分，Δ≥0.42)用于变异优先排序。样本来源包括HEK293T细胞基因组DNA、人血液基因组DNA及NCT/DKTK/DKFZ MASTER精准肿瘤学项目2例患者(1例胃肠道间质瘤和1例转移性子宫内膜间质肉瘤)的肿瘤DNA/RNA测序数据。

**研究结果**

**小基因构建与变异选择：** 基于铁硫簇功能结构域、外显子读码框及质粒大小限制，选择外显子2-5区域构建部分SDHB小基因。从481个至少一个SpliceAI Δ评分>0.2的SNV中优先筛选出48个最大Δ评分>0.42的变异(范围0.42–0.97，平均0.76)，其中10个位于经典剪接位点，16个位于外显子，22个位于内含子。检测前评估显示2个(可能)良性、14个(可能)致病、34个VUS。

**内源性及小基因衍生SDHB的转录本分析：** 内源性SDHB在HEK293T细胞中仅表达与MANE转录本NM_003000.3对应的单一异构体；野生型小基因产生的mRNA中96%与MANE转录本一致。36个变异(72.0%)检测到至少一种异常转录本，共观察到113个转录本，其中73个为异常转录本，对应22种独特异常转录本，包括部分外显子跳跃(40.9%)、伪外显子掺入(27.3%)、内含子保留(18.2%)、单外显子跳跃(9.1%)和多外显子跳跃(4.5%)。80.8%的异常转录本预计引入提前终止密码子(PTC)。48个SpliceAI优先排序变异中，17个(35%)显示≥90%异常剪接，而19个(40%)尽管具有≥0.42的未掩蔽评分却显示≥90%野生型表达。与传统凝胶电泳加Sanger测序相比，仅47%的NGS检出转录本可被传统方法检测到，凸显了NGS解析复杂剪接事件的敏感性优势。

**RNA分析整合至ACMG/AMP变异分类：** 依据Tayoun和Walker的建议，研究人员对PVS1决策树进行了基因和检测适配。导致PTC的异常转录本及预测破坏关键功能结构域(2Fe-2S铁氧还蛋白结构域，Pfam Fer2_3)的框内转录本均被赋予PVS1_Strong代码，64个异常转录本获得PVS1强度代码。通过补充决策树组合PVS1和BP7证据并采用保守阈值(≥80%功能缺失转录本对应PVS1_Strong(RNA)，≥90%野生型转录本对应BP7_Strong(RNA))，最终10个变异(含8个经典剪接位点变异)获得PVS1_Strong(RNA)，2个获得PVS1_Moderate(RNA)，14个内含子或同义变异获得BP7_Strong(RNA)。整合RNA证据后，26个获得RNA代码的变异中ACMG评分平均变化2.7分，17个变异(65.4%)发生级别转换，13个(50%)获得临床意义的重新分类：12个VUS降级为可能良性，1个(c.402T>A)由可能致病降级为VUS。

**选定变异及与原发肿瘤数据的比较：** 外显子4编码变异c.398T>G(p.Met133Arg)与c.402T>A(p.Tyr134Ter)均诱导部分外显子4跳跃(r.399_423del)并产生移码转录本，揭示了基于剪接的致病机制而非预期的错义或直接截短效应。内含子变异c.201-14T>G和c.287-3C>G虽位于非经典剪接位点，亦表现出显著的剪接破坏。与MASTER项目2例患者的肿瘤RNA测序数据比较显示，经典供体变异c.286+1G>A的肿瘤DNA存在杂合性丢失(VAF 93%)，肿瘤RNA证实外显子3跳跃及内含子3隐藏供体位点激活，小基因分析重现了这两种剪接事件(75%内含子3保留和25%外显子3跳跃)；受体变异c.287-1G>C的肿瘤RNA显示外显子4跳跃，小基因分析亦重现主要剪接异常(86%)，支持了小基因分析的有效性及其量化PTC转录本的能力。

**讨论与结论**

讨论指出，高SpliceAI评分虽对剪接破坏具有预测价值，但中等至高等未掩蔽评分(范围0.44–0.92)尤其对非经典内含子和外显子变异常对应以野生型剪接为主(40%)，提示计算机模拟优先排序的特异性有限；掩蔽评分可将其假阳性比例降至29%。NGS方法相比传统凝胶电泳的敏感性显著提高，但将转录本效应转化为稳健证据强度仍具挑战性，仅约50%的变异达到保守汇总阈值。框内转录异构体r.370_423del(p.Val124_Pro141del)在8个变异中丰度超过10%，因蛋白水平影响未明而未分配RNA代码。小基因分析相比基因组编辑方法提供了一种聚焦剪接的可解读读数，适合剪接预测的实验验证，但存在人工基因组环境、转录本复杂性可能偏倚及组织特异性调控减弱等局限。

研究结论：通过在HEK293T细胞中建立SDHB外显子2-5小基因模型，本研究提供了系统评估剪接相关变异的验证框架。整合靶向NGS、半自动化HGVS注释和AC