大豆（Glycine max L.）FCS样锌指（FLZ）基因家族的全基因组鉴定、表征、进化分析及非生物胁迫下的表达谱分析

《Scientific Reports》：Genome-wide identification, characterization, evolutionary analysis, and expression profiling of the FCS-like zinc finger (FLZ) gene family in soybean (Glycine max L.) under abiotic stresses

　　

干旱和盐分限制大豆产量。尽管FCS样锌指（FLZ）蛋白在SnRK1能量感知复合体中具有作用，但大豆中FLZ蛋白的系统性研究尚未见报道。研究人员对GmFLZ基因家族进行了全基因组鉴定，共鉴定出40个成员，分布于20条大豆染色体中的18条。对来自大豆（Glycine max）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的87个FLZ蛋白进行系统发育分析，揭示了4个主要进化支，表明其多样化早于单子叶植物和双子叶植物的分离。结构分析鉴定出10个保守基序，其中基序1和2存在于所有家族成员中。基因重复分析鉴定出304个旁系同源对，大多数源于片段重复。K_a/K_s分析表明，6个基因对存在局部正选择，97.9%的基因对受到纯化选择。跨9种组织的组织特异性表达谱显示，GmFLZ5、GmFLZ15、GmFLZ25和GmFLZ34在GmFLZ家族中表达水平最高，其中GmFLZ5在叶片、根瘤和茎中表达最高，在豆荚、根和根毛中中等表达，而GmFLZ18、GmFLZ23和GmFLZ37表现出根偏好性表达。在Giza 5品种中，干旱（20% PEG-6000）和盐（200 mM NaCl）处理下的RT-qPCR验证显示，40个GmFLZ基因中分别有36个和34个基因表现出至少两倍的表达变化，其中GmFLZ21和GmFLZ35在盐胁迫下诱导最强。这些发现为GmFLZ家族提供了进化和功能框架，并鉴定了未来在大豆胁迫耐受性功能研究中的候选基因。

大豆FLZ基因家族的全基因组解析及其非生物胁迫响应研究解读

FCS样锌指（FLZ）蛋白家族，亦称DUF581（未知功能结构域581），是植物特有的调节蛋白，含有高度保守的FLZ结构域，参与植物生长调控、衰老、糖信号及非生物/生物胁迫响应。尽管模式植物拟南芥、水稻、玉米等中已有FLZ家族研究，但大豆中该家族的系统性分析此前未见报道。大豆是世界重要经济作物，干旱和盐胁迫严重限制其产量。因此，研究人员开展全基因组鉴定与功能解析，旨在系统揭示GmFLZ基因家族的进化特征和胁迫响应表达模式，为培育耐逆大豆品种提供候选基因。

研究人员利用生物信息学与实验验证相结合的方法，从大豆基因组中鉴定出40个GmFLZ基因，分布于18条染色体。系统发育分析表明FLZ家族在单双子叶分化前已多样化。结构分析找到10个保守基序，其中基序1、2存在于所有成员。基因重复分析发现304个旁系同源对，主要为片段重复，且97.9%受纯化选择。组织表达谱显示部分基因具有组织偏好性。RT-qPCR验证表明多数GmFLZ基因响应干旱和盐胁迫。该研究为大豆FLZ家族提供了进化和功能框架。

主要技术方法方面，研究人员利用Phytozome v14.0数据库获取大豆全基因组和蛋白组数据，通过HMMER和BLASTP搜索，经SMART和InterProScan验证，鉴定出40个GmFLZ基因。使用MEGA构建NJ系统发育树，MEME分析保守基序，PlantCARE预测顺式作用元件，MCScanX检测基因重复事件并计算K_a/K_s，利用RNA-seq数据绘制组织表达热图。实验验证采用Giza 5品种（埃及农业研究中心提供）幼苗，用20% PEG-6000和200 mM NaCl分别模拟干旱和盐胁迫，在处理后0、1、3、6、12、24小时取叶片，通过RT-qPCR（实时荧光定量PCR）检测40个基因的表达。

研究结果如下：

（一）GmFLZ基因家族成员的鉴定：通过结构域搜索和验证，共鉴定40个GmFLZ基因，编码105–443个氨基酸，分子量11.97–49.02 kDa，多数蛋白预测不稳定，39个含两个外显子。

（二）GmFLZ基因的染色体定位与基因组分布：40个基因不均匀分布在18条染色体上，8号和12号染色体无成员，17号染色体最多（4个），其余染色体含1–3个。

（三）大豆FLZ蛋白家族的系统发育与结构分析：将大豆、拟南芥、水稻共87个FLZ蛋白构建系统发育树，分为4个主要进化支（cluster1–4），cluster1仅含水稻基因，其他三支包含三个物种，表明多样化早于单子叶-双子叶分离。

（四）亚细胞定位预测分析：PSORT预测显示多数GmFLZ蛋白定位于细胞核，如GmFLZ2、GmFLZ3、GmFLZ9等；GmFLZ17、GmFLZ26、GmFLZ28、GmFLZ29、GmFLZ30预测定位于叶绿体；GmFLZ4、GmFLZ19、GmFLZ39中等定位于线粒体；GmFLZ1定位于细胞质。

（五）系统发育关系、保守结构域、基因结构和基序组织：系统发育将40个GmFLZ分为三组，所有成员含zf-FLZ结构域，基序1、2为所有成员共有；不同组另含不同辅助基序，基因结构多数含两个外显子，长度差异大，同一进化支的结构相似。

（六）GmFLZ基因家族的共线性和进化关系：种内共线性显示大量片段重复；种间比较发现与拟南芥47对直系同源，与水稻31对，与玉米25对；多个基因存在一对多关系，表明FLZ家族起源于单双子叶分化前，全基因组重复（WGD）驱动家族扩张。

（七）GmFLZ基因启动子顺式作用元件分析：2 kb启动子区域含多种胁迫响应元件（MBS、LTR、ARE、TC-rich）、激素响应元件（ABRE、CGTCA、TGACG等）及光响应、发育相关元件，其中ABRE和MeJA响应元件最丰富，表明受复杂调控。

（八）基因重复分析与进化速率：共鉴定304对重复基因，其中290对片段重复，14对串联重复。K_a/K_s值范围0.00–2.63，98.0%的基因对<1，受纯化选择；6对>1，可能正选择。重复时间约2.9–264.0百万年前（Mya）。

（九）GmFLZ候选基因在9种组织中的表达模式：RNA-seq数据显示多数GmFLZ基因在各组织中表达低（FPKM 0–20），GmFLZ5、GmFLZ15、GmFLZ25、GmFLZ34表达较高，GmFLZ5在叶、根瘤、茎中最高；GmFLZ18、GmFLZ23、GmFLZ37在根中高表达；花、种子、茎尖分生组织中普遍低表达。

（十）干旱和盐胁迫下GmFLZ家族的表达谱：RT-qPCR结果显示，干旱胁迫下36个基因至少两倍表达变化，盐胁迫下34个；干旱下19个上调19个下调，盐下24个上调16个下调。GmFLZ21在盐胁迫24 h诱导28.6倍，GmFLZ35为23.3倍，GmFLZ28在干旱3 h为23.1倍。32个基因在两种胁迫下均有响应，大部分响应重叠。

（十一）GmFLZ-转录因子共表达网络：利用GM-CX数据库，23个GmFLZ基因与79个转录因子形成97个共表达互作，GmFLZ25、GmFLZ18、GmFLZ34贡献42%互作，可能处于调控网络中心。

（十二）GmFLZ共表达网络的GO富集：GO分析显示显著富集于亚油酸13S-脂氧合酶活性、9S-脂氧合酶活性、脂质氧化、茉莉酸生物合成等，而蛋白结合、水分剥夺响应等显著不足，提示共表达网络集中于脂氧合酶和茉莉酸途径。

讨论部分总结：GmFLZ蛋白的保守结构域和预测不稳定特性与调节蛋白一致；核定位支持其在SnRK1信号中的角色；叶绿体和线粒体定位提示可能参与光合保护等新功能；基因结构和基序多样化可能促进功能分化；片段重复和纯化选择是家族扩张和保守的主要驱动力；顺式元件多样性表明受激素和环境信号多重调控；组织特异性表达提示功能分工；胁迫表达谱证实家族广泛参与非生物胁迫响应；共表达网络及GO富集提示与茉莉酸/脂氧合酶途径相关。研究结论为：在大豆中鉴定出40个GmFLZ基因，系统发育分析支持其祖先早于单子叶-双子叶分化；重复分析表明片段重复和纯化选择主导进化；表达分析鉴定出根偏好和高表达候选基因；RT-qPCR证实多数基因响应干旱和盐胁迫。这些发现为GmFLZ家族提供了进化与功能框架，并为大豆耐逆育种提供了优先功能验证的候选基因。