天然抗氧化剂提升爪哇无须魮（Javaen barb，Systomus rubripinnis）冻融后精子质量与受精性能

《Antioxidants》：Natural Antioxidants Enhance Post-Thaw Sperm Quality and Fertilization Performance in Javaen Barb (Systomus rubripinnis)

　　

精子冷冻保存中的冻融过程会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），损害包括爪哇无须魮（Systomus rubripinnis）在内的鱼类精子运动力、活率与受精能力；该物种是印度尼西亚特有鲤科鱼类，具保护关注价值。冷冻保存支撑水生遗传资源基因库建设，并辅助生物多样性保护及孵化场种群增强。研究人员评估了五种天然抗氧化剂：罗勒叶提取物（basil leaf extract，BLE）、诺丽果提取物（noni fruit extract，NFE）、辣木叶提取物（moringa leaf extract，MLE）、穿心莲叶提取物（sambiloto leaf extract，SLE）与蜂蜜—蛋黄（honey–egg yolk，HEY）。各抗氧化剂按梯度浓度加入 Kurokura 冷冻稀释液（Kurokura’s cryopreservation extender）：BLE 1–4%、NFE 与 MLE 0.5–1.5%、SLE 6–9%、HEY 1–2% 且固定 5% 蛋黄，并与无抗氧化剂对照比较。自由基清除能力用 DPPH 法测 IC50（BLE 134.06、MLE 297.04、NFE 422.86、SLE 3010.46 ppm），并评估冻后运动力、运动持续时间、活率、畸形率、受精率与 ATP 生物发光。最佳剂量为 BLE、NFE、MLE 各 1%，HEY 1.25%，SLE 7%。BLE 1% 综合最优（运动力 85.00 ± 0.88%；持续时间 7.14 ± 0.38 min；活率 82.00 ± 1.86%；畸形率 18.26 ± 0.16%），显著优于对照（65.00 ± 2.31%；4.56 ± 0.33 min；68.00 ± 2.42%；23.54 ± 0.28%；p < 0.05），而 SLE 维持最长运动时间。所有提取物受精率均高于 82%，对照为 70.08 ± 3.82%；1% BLE 冻后发光值与鲜精相当（165,217 对 164,087 RLU）。这些本地植物源抗氧化剂为爪哇无须魮种质保护、保护型孵化场与亲鱼管理、可持续水产生产及内陆渔业社区粮食安全提供低成本路径。

论文解读：天然抗氧化剂改善濒危爪哇无须魮精子冷冻保存性能

研究背景方面，爪哇无须魮（Systomus rubripinnis）为爪哇岛特有小型淡水鲤科鱼类，具有生态指示、观赏鱼贸易与地方渔业文化价值，世界自然保护联盟（IUCN）红色名录评为易危（Vulnerable）。其野生种群因农业面源污染、生境退化、采砂沉积及观赏鱼过度捕捞而急剧下降。精子冷冻保存（sperm cryopreservation）是外源迁地保护（ex situ conservation）与基因库建设的核心生物技术，可在 ?196 °C 长期保存精子，突破自然繁殖周期限制。但冻融循环会破坏线粒体电子传递链，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），引发精子质膜多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）脂质过氧化、DNA 断裂与线粒体功能障碍，最终导致冻后运动力下降、质膜完整性与受精能力受损。合成抗氧化剂存在生物相容性与环境安全顾虑，因此研究人员转向植物源天然抗氧化剂，但罗勒、诺丽、辣木、穿心莲及蜂蜜—蛋黄体系在爪哇无须魮精子冷冻中的应用此前缺乏系统研究。

研究人员以爪哇无须魮为对象，在 Kurokura 稀释液中分别添加 BLE、NFE、MLE、SLE 与 HEY，设置梯度浓度并设无抗氧化剂对照，评价冻后精子质量与受精表现，测定 DPPH 自由基清除 IC₅₀、运动力、运动持续时间、活率、畸形率、ATP 生物发光（relative luminescence units，RLU）与受精率，旨在筛选最适天然抗氧化剂及剂量，为特有淡水鱼保护提供基于自然的冷冻方案。

主要技术方法上，研究人员于西爪哇 Jatinangor 的 Ciparanje 湿实验室，在繁殖季取 15 尾雄鱼经催产与麻醉后腹部挤压采精，仅纳入鲜精运动力大于 80% 的样本并混合为同一池化样本；雌鱼卵也池化后用于受精试验。冷冻采用 10% 甲醇 + Kurokura 液加各抗氧化剂，1:10 精稀比装 0.25 mL 细管，液氮面上方预冷后浸入 ?196 °C，48 h 后 25 °C 水浴解冻。质量评价包括显微镜运动与持续时间观测、Cell Counting Kit-8（CCK-8）活率、CellTiter-Glo 2.0 的 ATP 发光、八细胞期计数受精率，统计用 arcsin 平方根转换后单因素方差分析与 Duncan 多重比较（p < 0.05）。

研究结果如下。

天然提取物的抗氧化活性（IC₅₀）：DPPH assay 显示 BLE 抗氧化最强，IC₅₀ 为 134.06 ppm；MLE 为 297.04 ppm，NFE 为 422.86 ppm；SLE 最弱，IC₅₀ 为 3010.46 ppm；HEY 为复合生物基质未做 DPPH。结果表明提取物自由基清除能力与后续添加浓度区间设计一致。

BLE 补充下的冻后精子质量：研究人员设 1–4% BLE，发现 1% BLE 冻后运动力 85.00 ± 0.88%、持续时间 7.14 ± 0.38 min、活率 82.00 ± 1.86%、畸形率 18.26 ± 0.16%，均显著优于对照；2% BLE 受精率最高（92.60 ± 0.57%）。结论为低剂量罗勒多酚清除 ROS、稳定质膜，过高浓度可能出现促氧化或膜毒性。

NFE 补充下的冻后精子质量：研究人员设 0.5–1.5% NFE，1% NFE 运动力 81.00 ± 3.28%、持续时间 5.41 ± 0.28 min、活率 71.00 ± 3.51%，畸形率最低（8.37 ± 0.38%）；1.25% NFE 受精率最高（90.30 ± 1.91%）。结论为诺丽果黄酮与环烯醚萜可清除自由基并上调超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等内源酶，但高浓度致运动持续时间骤降。

MLE 补充下的冻后精子质量：研究人员设 0.5–1.5% MLE，1% MLE 运动力 79.00 ± 1.39%、持续时间 5.96 ± 0.20 min、畸形率 7.57 ± 0.39%；受精率也以 1% 最高（87.82 ± 7.85%）。结论为辣木酚类与维生素抑制 PUFA 脂质过氧化，1.5% 时畸形率回升至 20.07 ± 0.15%，显示双相剂量反应。

HEY 补充下的冻后精子质量：研究人员用 1.0–2.0% 蜂蜜 + 固定 5% 蛋黄，Honey 1.25% + EY 5% 运动力 74.00 ± 3.02%、持续时间 5.56 ± 0.39 min、畸形率 6.77 ± 0.47%，受精率 87.89 ± 1.78%。结论为蜂蜜单糖造成高渗脱水、蛋黄低密度脂蛋白（low-density lipoproteins，LDL）吸附尾膜修补微裂，二者协同拓宽保护浓度窗。

SLE 补充下的冻后精子质量：研究人员设 6–9% SLE，7% SLE 运动力 81.00 ± 3.18%，全部 SLE 组持续时间 7.54–8.15 min，显著长于对照 4.56 min；7% 受精率 89.64 ± 0.54%。结论为穿心莲内酯（andrographolide）可能维护轴丝完整与线粒体氧化磷酸化，使运动持续时间最长，但因 DPPH 弱需高浓度才具功能当量。

ATP 生物发光：24 个配方 RLU 从 SLE 6 的 28,328 到 NFE 1 的 1,312,703 不等，鲜精参考为 164,087。HEY、MLE 与低剂量 SLE/NFE 接近鲜精；高剂量 BLE/NFE 与 SLE 7 远超鲜精。研究人员指出冷冻不会生成 ATP，异常高值可能来自酚类对荧光素—荧光素酶（luciferin–luciferase）反应的光学干扰或基质腺苷酸污染，因此 RLU 仅作相对比较。

讨论部分总结：研究人员认为 BLE 因富含 eugenol、linalool、quercetin 与 rosmarinic acid，在低剂量下最均衡改善运动、活率与受精；NFE 与 MLE 通过直接清除与酶系统上调降低畸形；HEY 胜在膜稳定与渗压调节；SLE 虽抗氧化力弱，却独特地延长鞭毛驱动时长。ATP 高值被解释为 assay 矩阵效应而非真正能量升高。局限包括单池化雄鱼样本、未做 LC-MS/MS 成分定量、未测丙二醛（malondialdehyde，MDA）/DNA 碎片、HEY 中蜂蜜与蛋黄效应未分离、各配方渗透压/pH/黏度未匹配、受精后孵化与仔鱼存活未追踪。

结论部分翻译：爪哇无须魮精子冷冻保存的最适抗氧化剂浓度为 BLE 1%、NFE 1%、MLE 1%、HEY（Honey 1.25% + Egg Yolk 5%）与 SLE 7%；其中 BLE 获最高冻后运动力（85%）与活率（82%），所有抗氧化剂处理冻后受精率均大于 82%，ATP 生物发光表明 1% BLE 使冻后精子能量状态与鲜精相当，符合剂量依赖响应。这些植物源抗氧化剂为爪哇无须魮孵化场与特有淡水鱼保护项目改善冷冻协议提供实用且科学支持的路径；其本地易得、低成本、可生物降解、低毒且对实验设施要求低，尤其适合社区型与小规模保护孵化场。BLE 综合保护最强，SLE 以延长运动持续时间为特色。因本研究比较离散浓度而非正式优化，后续可用响应面法精确定量最适添加水平。论文发表于《Antioxidants》。