松果菊苷-铜金属酚醛网络水凝胶体系负载二烯丙基三硫醚用于宫颈癌局部治疗

《Pharmaceutics》：Study on Echinacoside-Copper Metal–Phenolic Networks Hydrogel System Loaded with Diallyl Trisulfide for Local Treatment of Cervical Cancer

　　

背景/目的：宫颈癌细胞可通过上调抗氧化防御（如谷胱甘肽(GSH)）逃避化疗。同时放大活性氧(ROS)并抑制抗氧化防御是一种低毒策略。本研究提出一种结合化学动力学治疗(CDT)与化疗的局部纳米平台用于宫颈癌局部治疗。方法：通过一步配位组装将二烯丙基三硫醚(DATS)载入松果菊苷(ECH)-铜金属酚醛网络(MPN)纳米颗粒（ECD NPs），再将其加入泊洛沙姆/羟丙基甲基纤维素(HPMC)热敏水凝胶中用于阴道递送。对制剂的粒径、载药量、溶胶-凝胶转变及pH响应释放进行表征；通过Cu2+摄取、GSH耗竭、ROS蓄积、凋亡标志物及活力在SiHa和HeLa细胞中评价抗肿瘤活性；在原位宫颈癌模型中评估体内疗效与生物安全性。结果：ECD NPs粒径约135 nm，DATS载药量约27.6%；载ECD NPs水凝胶在36.7 °C发生溶胶-凝胶转变；24 h内DATS释放率在pH 7.4为16.4%、pH 4.5为32.4%、pH 6.5为64.8%、pH 5.6为80.9%，即阴道pH下泄漏少、肿瘤pH下明显触发、溶酶体pH下最快，证实pH响应行为。该水凝胶增强Cu2+摄取、耗竭GSH、升高ROS，80 μg/mL时细胞活力低于50%；原位模型中肿瘤抑制率达87.81%，优于游离DATS（65.3%）和空白MPN水凝胶（55.62%），且无明确全身毒性。结论：ECD NPs水凝胶触发Cu2+驱动的ROS/GSH级联，将铜介导的氧化应激与DATS诱导的凋亡结合以增强抗肿瘤活性；其阴道局部化、pH响应释放和生物安全特征支持进一步用于宫颈癌治疗。

研究背景方面，宫颈癌是全球女性第四常见恶性肿瘤，年轻患者增多使保留生育功能需求上升。现有根治性手术有生殖器官损伤与术后并发症风险，全身化疗则有骨髓抑制、神经毒性和性腺毒性等剂量限制性毒性。宫颈解剖位置允许阴道局部给药，从而绕过全身循环并提高局部药物浓度。热敏水凝胶具备生物相容性、多孔结构和缓释能力，泊洛沙姆类体系室温为流动溶胶、体温下成半固体凝胶，可贴合不规则黏膜面；但传统热敏水凝胶多为被动储库，不能响应肿瘤微环境(TME)的弱酸性等线索，易致药物提前泄漏。二烯丙基三硫醚(DATS)是大蒜来源有机硫化物，有宫颈癌抗肿瘤活性，但挥发强、化学不稳定、水溶性差且气味刺激；更关键的是癌细胞高谷胱甘肽(GSH)会中和活性氧(ROS)，削弱DATS氧化应激效应。金属酚醛网络(MPN)由金属离子与多酚配体自组装形成，酸性和肿瘤微环境中可解离并释放Cu²⁺等金属离子，催化类芬顿反应产羟基自由基(·OH)并耗竭GSH，从而实现化学动力学治疗(CDT)。常规MPN多用单宁酸、没食子酸等无内在药效的多酚；研究人员因此选用具内在抗肿瘤活性的松果菊苷(ECH)作为双功能配体，构建ECH-Cu²⁺-DATS纳米颗粒（ECD NPs）并载入泊洛沙姆/HPMC热敏水凝胶，用于阴道局部、pH响应、协同CDT与化疗的宫颈癌治疗。该论文发表在《Pharmaceutics》。

主要关键技术方法方面，研究人员以人宫颈癌SiHa与HeLa细胞、小鼠U14宫颈癌细胞及雌性昆明(KM)小鼠原位宫颈癌模型为对象；采用配位自组装制备ECH-Cu²⁺与ECD纳米颗粒，并以动态光散射、透射电镜、傅里叶变换红外光谱和高效液相色谱表征理化性质与载药量；以流变、扫描电镜和透析袋法评估热敏水凝胶凝胶化、形貌及pH依赖药物释放；以MTT、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)流式、GSH试剂盒、ROS试剂盒、Cu²⁺试剂盒、ELISA与 caspase-3/7活性检测阐明机制；体内以阴道给药评估肿瘤质量、肿瘤抑制率、H&E与TUNEL染色及主要脏器毒性。

研究结果方面，3.1 制备与理化表征：通过一步搅拌、ECH与Cu²⁺摩尔比2:1制得EC NPs，载入DATS后ECD NPs流体力学直径约135 nm、zeta电位-29 mV，透射电镜呈规则球形，紫外与红外证据显示酚羟基与Cu²⁺配位且DATS成功封装，HPLC示载药量27.6%，15天粒径与多分散指数稳定，证明MPN平台可高载药并具胶体稳定性。

3.2 凝胶行为、pH响应降解与释放：水凝胶具三维多孔网络，36.7 °C发生溶胶-凝胶转变，pH 5.6下24 h降解约80%；DATS释放随酸度增强，pH 7.4仅16.4%、阴道pH 4.5为32.4%、肿瘤外pH 6.5为64.8%、溶酶体pH 5.6达80.9%，且溶血率低于5%，说明局部应用有pH触发释放与血液相容性。

3.3 体外细胞毒与促凋亡：MTT示ECD NPs水凝胶浓度依赖抑制SiHa与HeLa增殖，80 μg/mL时HeLa活力45.93%、SiHa为52.13%，优于游离DATS水凝胶；形态学见广泛皱缩、脱壁和碎屑；Annexin V-FITC/PI示SiHa总凋亡64.3%、HeLa为62.4%，高于单药组，表明Cu²⁺氧化应激与DATS凋亡通路互补。

3.4 机制：Cu²⁺摄取、GSH耗竭、ROS升高：ECD NPs水凝胶使细胞内Cu²⁺升至SiHa 6.4 nmol/10⁶细胞、HeLa 5.8 nmol/10⁶细胞；GSH降至SiHa 85.0%、HeLa 80.0%；ROS荧光增强。酸性溶酶体中Cu²⁺催化类芬顿反应生成·OH并将GSH氧化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)。BAX上调、Bcl-2下调，BAX/Bcl-2比与caspase-3/7活性在ECD组最高，证明通过线粒体内源性途径执行凋亡。

3.5 体内疗效与生物安全：原位U14模型中，ECD NPs水凝胶组体重稳定、无死亡，肿瘤抑制率87.81%，显著高于游离DATS水凝胶65.3%与EC NPs水凝胶55.62%；心肝脾肺肾H&E无异常，肿瘤H&E见核碎裂，TUNEL见广泛棕染凋亡核，说明局部高效且系统耐受良好。

讨论部分总结：研究人员指出ECH替代惰性多酚使MPN由被动载体变为治疗参与者，27.6%高载药来自MPN多孔网络；热敏水凝胶在36.7 °C成胶，阴道pH泄漏少、肿瘤与溶酶体pH释放增强，HPMC提升黏附滞留，优于被动储库；Cu²⁺经类芬顿与GSH氧化双途径放大氧化应激，DATS经BAX/Bcl-2失衡促线粒凋亡，两轴分别攻击ROS生成与清除，克服单药抗氧化补偿耐药；天然来源组分与阴道给药降低全身暴露，对年轻保生育患者具转化价值；局限包括U14模型不完全代表人宫颈癌、ECH独立贡献未完全拆开、正常宫颈/阴道上皮选择性未测、铜产·OH与溶酶体释放未直接验证、长期稳定性与生殖毒性待研。

结论部分翻译：本研究开发了用于宫颈癌局部治疗的ECD NPs负载热敏水凝胶，创新覆盖制剂设计、机制阐释与转化验证。在制剂层面，ECH用作Cu²⁺配位的双功能多酚配体，脱离常规惰性MPN支架；所得pH响应体系实现高DATS载药与触发释放，克服被动滞留水凝胶局限。在机制层面，该平台建立协同级联：Cu²⁺介导的GSH耗竭与ROS生成，协同DATS诱导的BAX/Bcl-2失调和caspase-3/7激活，有效克服宫颈癌细胞氧化还原耐药。在原位小鼠模型中，水凝胶获87.81%肿瘤抑制率且无明确全身毒性，支持其作为低系统毒性的局部疗法。除本应用外，该工作表明功能性多酚选择可将MPN从被动载体转为主动治疗参与者，为协同抗癌提供可推广策略。