平滑肌细胞MAPK14促进高脂血症衰老过程中的血管钙化

《Cells》：Smooth Muscle Cell MAPK14 Promotes Vascular Calcification During Hyperlipidemic Aging

　　

血管钙化是血管衰老的一个标志性特征，高脂血症可加速其进程，并与不良心血管结局相关。尽管血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管钙化的关键介质，但将衰老相关应激与成骨重塑联系起来的信号通路仍未完全阐明。为明确MAPK14（p38α）在血管衰老中的作用，研究人员将年轻和老年小鼠主动脉的批量RNA测序（bulk RNA sequencing）数据与已发表的VSMC特异性Mapk14敲除（knockout, KO）小鼠单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）数据进行了整合分析。批量RNA-seq鉴定出与衰老相关的细胞外基质重塑、钙化、炎症和衰老相关基因程序的激活，并伴随p38 MAPK信号增强。单核RNA-seq进一步证明，Mapk14 KO可减弱VSMCs中增殖、炎症、纤维化和骨化相关基因模块的表达。与这些转录组学发现一致，RUNX2表达在老年主动脉中显著增加，而老年Mapk14 KO小鼠与野生型对照相比，表现出RUNX2表达降低，同时血管钙化、纤维化和炎症细胞浸润均减轻。总之，这些结果确定VSMC MAPK14是高脂血症衰老过程中血管钙化的重要调节因子，并证明MAPK14缺陷与RUNX2表达降低及纤维炎症性血管重塑减弱相关。这些发现支持MAPK14作为限制衰老过程中血管钙化及相关病理重塑的潜在治疗靶点。

血管衰老以动脉壁进行性结构和功能重塑为特征，包括僵硬度增加、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重组和钙化，共同导致心血管疾病发病率和死亡率升高。血管钙化是血管衰老的标志性特征，已被认为是一个主动调控的、细胞驱动的过程，而非被动退行性事件。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）在此过程中通过获得成骨表型发挥核心作用。转录因子RUNX2是成骨分化的主调控因子，对VSMCs中成骨基因程序的激活和血管钙化至关重要。然而，将衰老相关应激与RUNX2激活及钙化重塑联系起来的上游信号通路仍未完全阐明。MAPK14编码p38α——p38 MAPK家族的主要亚型，是一种应激激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，可整合多种细胞应激信号并调节炎症、衰老、ECM重塑和细胞命运决定。既往研究已表明MAPK14促进VSMC表型调节并参与新生内膜增生和动脉瘤形成，但MAPK14是否在高脂血症衰老过程中调节RUNX2表达并促进血管钙化尚不清楚。

为此，研究人员利用Apoe^?/?背景的VSMC特异性Mapk14敲除（knockout, KO）小鼠模型，整合已发表的批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）数据集，结合Western blot、组织学染色和免疫荧光等手段，系统研究了平滑肌细胞MAPK14在年龄相关血管钙化中的作用。研究发现，VSMC特异性MAPK14缺陷可降低RUNX2表达并减弱血管钙化、纤维化和炎症重塑，确定MAPK14是高脂血症衰老过程中血管钙化的重要调节因子，支持其作为限制衰老相关血管钙化的潜在治疗靶点。该论文发表在《Cells》期刊。

关键技术方法主要包括：整合分析已发表的批量RNA-seq（GSE145972）和snRNA-seq（PRJNA1332774）数据集进行转录组学分析；Western blot检测RUNX2、MAPK14、p21和p16蛋白表达；von Kossa和茜素红染色评估血管钙化；Masson三色和天狼星红染色评估纤维化；免疫荧光染色检测RUNX2、ACTA2、COL1A1和LGALS3。样本来源于Apoe^?/?背景的SM22-Cre；Mapk14^f/f小鼠（KO）与SM22-Cre；Apoe^?/?小鼠（野生型，WT），雄鼠于26、60、65、86周龄处死，雌鼠于55和86周龄处死。

研究结果包括以下四个方面：**3.1 衰老激活主动脉中MAPK14相关的钙化和炎症基因程序**——对批量RNA-seq数据的重新分析显示，老年血管中ECM、钙化、炎症和衰老相关基因集的代表性基因表达增加，p38 MAPK信号相关基因也随衰老上调；snRNA-seq分析进一步表明，MAPK14缺陷可下调VSMCs中增殖、炎症、纤维化和骨化基因模块。**3.2 RUNX2表达随衰老增加并被VSMC特异性MAPK14缺陷所降低**——Western blot显示86周龄主动脉中RUNX2蛋白表达较26、60、65周龄组显著升高，衰老标志物p21和p16也升高，而总MAPK14/p38α蛋白无年龄相关变化；snRNA-seq和Western blot均证实KO小鼠RUNX2表达降低，免疫荧光染色显示老年KO主动脉中总RUNX2阳性细胞和RUNX2阳性ACTA2⁺ SMC比例均较WT显著减少。**3.3 VSMCs中MAPK14缺失减弱老年高脂血症小鼠的血管钙化**——对86周龄小鼠主动脉弓和升主动脉的分析显示，KO小鼠大体血管病变较WT减少；von Kossa和茜素红染色定量分析均证实KO小鼠钙化面积和钙沉积减少，雌雄两性结果一致。**3.4 VSMCs中MAPK14缺失减弱衰老过程中的血管纤维化和炎症**——Masson三色染色显示KO小鼠纤维化面积减少，天狼星红染色证实胶原沉积减少；免疫荧光染色显示KO主动脉中COL1A1阳性（