综述：颅颌面区域生物打印：再生医学与口腔医学的新纪元

《Journal of Functional Biomaterials》：Bioprinting the Craniofacial Region: A New Era in Regenerative Medicine and Dentistry

　　

背景：三维（3D）打印和生物打印已成为组织工程和再生医学中的变革性技术。传统3D打印能够制造复杂、可定制的支架，模拟天然细胞外基质（ECM），为细胞黏附、增殖和分化提供必要的机械支持。相比之下，3D生物打印将生物材料、生长因子和活细胞整合到生物墨水中，实现组织样结构的精确逐层构建。目的：本综述旨在强调传统3D打印和3D生物打印在再生医学中的最新进展和应用，特别关注颅颌面组织再生，重点阐述基于支架和负载细胞两种方法的独特作用。方法：研究人员对当前文献进行了全面分析，考察了用于颅颌面组织工程的常规3D打印和生物打印方法，重点关注打印技术、生物墨水组成与选择、支架设计和细胞来源，及其在多种组织类型中的应用。结果：近期发展表明，常规3D打印能够制造可定制支架，而3D生物打印则能生成高度有序、负载细胞的构建体，其结构高度接近天然组织结构。这些技术在开发患者特异性疾病模型和用于颅颌面组织（包括骨、牙、气管、眼、肌肉和神经组织）的再生植入物方面显示出良好前景。结论：3D打印和生物打印为颅颌面再生医学提供了强大平台。生物墨水配方、打印精度和生物学整合方面的持续进步有望进一步提升其转化和临床潜力。

1. 1.
   3D打印与3D生物打印

三维（3D）打印通过生产基于水凝胶的支架显著推进了组织工程，这些支架紧密模仿天然细胞外基质（ECM），为细胞生长和分化提供了有利环境。3D打印支架在再生医学中被用作无细胞支架和后接种支架。后接种支架是在制造后随后将细胞接种到其上的常规打印支架。最近的创新通过引入含有活细胞、生长因子和纳米颗粒的生物墨水（即生物打印过程）改善了这些支架的功能。生物制造是一个新兴领域，涉及以自动化方式生成具有生物学功能的产品，通常使用生物活性分子、活细胞、细胞聚集体或混合细胞材料构建体。生物打印被确定为一种能够以高度可重复和标准化的方式显著改善所得生物制造结构架构控制的新技术。本质上，3D生物打印促进了具有空间异质性的复杂结构的制造过程，这些结构紧密模仿所复制组织的自然结构。与传统组织工程技术相比，生物打印在空间控制负载细胞构建体的纳米、微米和宏观结构方面表现出优越性能，这归因于3D生物打印结构能够同步生物墨水的沉积和交联与电动平台的移动。尽管组织生物打印有许多优势和优点，但仍存在若干挑战和知识空白，阻碍了生物打印技术的规模化潜力，包括目标组织的复杂性、打印后组织维持和成熟、缺乏血管化、神经调节、淋巴引流以及细胞生长和分化所需的多重支持细胞类型，以及缺乏统一和规模化制造3D生物打印结构的战略规划，以及缺乏明确的生物打印构建体监管框架。此外，商业3D生物打印机和生物墨水成本上升可能严重限制对生物打印技术的获取。尽管如此，生物打印的多功能性加速了组织工程应用，现有证据将这些应用按生物打印方法分为三类：（1）挤出式生物打印，（2）喷墨/液滴生物打印，以及（3）激光辅助生物打印（LaBP）。总之，3D打印方法主要根据在打印过程中是否将活细胞、生长因子或激素整合到打印材料中来定义。

1. 2.
   生物墨水选择

确保成功生物打印结果的关键步骤是尽早选择生物墨水的生物材料，以保证打印性和所得结构的长期可用性。理想生物墨水被描述为具备必要的机械、流变、化学和生物学特性，以实现打印性与生物学支持的最佳平衡。常用于生物墨水组成的材料包括Pluronic、聚乙二醇（PEG）、明胶和其他剪切稀化生物材料，它们在挤出过程中的高剪切应力下表现为液态，一旦生物打印后迅速恢复凝胶状态，防止结构塌陷。迄今为止，由天然生物聚合物如海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖和琼脂糖以及多种合成聚合物如PEG和Pluronic合成的水凝胶满足了作为生物墨水材料的某些基本要求。生物墨水的选择意义远不止生物打印的初步阶段，它决定了将用于进一步稳定生物打印结构的二次交联机制。交联通过物理或化学机制发生，物理交联与非共价相互作用相关，而化学交联与产生新的共价键相关。Kolesky等人的研究介绍了一种利用3D生物打印创建复杂结构的新方法，结合了多种细胞类型、ECM成分和血管网络，使用同轴挤出式生物打印技术逐层排列，结果被视为生物打印具有多样细胞群和独特循环网络的组织构建体的概念验证。

1. 3.
   3D生物打印在颅颌面区域的应用

3.1 骨与软骨再生

三维支架被设计成模仿天然组织的ECM，以促进细胞黏附、增殖和组织发育，同时引导组织再生并提供机械支持。Yu等人开发了一种3D生物打印支架，利用干细胞和细胞衍生囊泡制备功能性生物墨水治疗牙周炎引起的骨异常，使用了人牙周膜干细胞（hPDLSCs）和明胶-海藻酸盐-丝素蛋白（GAS）复合材料，通过挤出式3D生物打印和双交联工艺增强支架机械和结构完整性。Wang等人设计了TZGP复合支架用于糖尿病环境下的骨再生，整合了ZnO纳米颗粒和α-磷酸三钙（α-TCP）水泥，通过3D打印辅助挤出方法制造，结果显示该支架减少了活性氧积累、减轻DNA损伤并促进细胞增殖和成骨-血管生成分化。Li等人利用ICIE16玻璃配方的3D打印支架在兔模型中观察到优异骨生长，人骨髓干细胞（hBMSCs）培养在该支架上显示出显著更高的成骨和ECM标志物表达。Dahl等人使用基于β-磷酸三钙（β-TCP）的Ossi Ink创建了可吸收3D打印骨植入物，在猪下颌模型中显示逐渐降解伴随血管化和新骨形成。Markstedt等人利用纳米纤维素-海藻酸盐（NFC-海藻酸盐）生物墨水生物打印软骨样结构，人软骨细胞存活率超过73%，7天后超过85%。Prasopthum等人引入了快速一步法3D打印方法创建具有微纳表面孔的聚合物支架，增强了间充质干细胞（MSCs）的软骨和成骨分化。Nowicki等人结合形状记忆聚己内酯（PCL）和纳米晶羟基磷灰石（nHA）开发骨软骨组织构建体。ECM基生物墨水也被提出用于再生人类软骨，结合GelMA、透明质酸甲基丙烯酸酯和硫酸软骨素甲基丙烯酸酯，与转化生长因子-β1（TGF-β1）共同支持软骨修复。Rubí-Sans等人将纳米纤维自组装肽水凝胶（RAD16-I）与PCL结构结合构建混合3D支架用于关节软骨再生。

3.2 牙科再生

研究人员开发了一种混合3D生物打印技术，结合热塑性支架（PCL）和负载人牙髓干细胞（hDPSCs）的纤维蛋白基生物墨水，制造患者特异性牙本质-牙髓构建体，较高浓度的纤维蛋白原诱导更强的成牙本质分化。Athirasala等人将海藻酸钠与牙本质基质结合开发独特生物墨水，保持了极高细胞活力并显著刺激成牙本质分化。一项2023年研究开发了用于牙周再生的生物活性复合支架，由生物活性玻璃微球（BGM）、海藻酸钠（SA）和GelMA组成，在比格犬牙周异常模型中观察到牙龈、牙周韧带和牙槽骨的强再生。Raveendran等人优化了牙周膜（PDL）细胞的3D生物打印程序。Lin等人创建了3D打印胶原基微纤维支架，波形纤维比直纤维表现出更好的细胞活力、铺展和黏附。3D打印还被用于制造临时和最终的上颌面部阻塞器，包括使用立体光刻3D打印塑料模型指导空心球阻塞器的构建，以及使用聚醚醚酮（PEEK）框架的全数字化方法。

3.3 气管再生

Valle-Pérez等人开发了一种具有自愈合和弹性的超短肽基生物墨水用于3D生物打印气管样结构，有效支持间充质基质细胞分化为软骨细胞。Gao等人提出了组织工程气管（TET）概念，使用3D打印PCL支架接种软骨细胞，在兔模型中显示成熟软骨特征。随后他们使用3D打印聚左旋乳酸（PLLA）支架和自体耳廓软骨细胞，结合体外动态预培养和体内带蒂肌瓣预血管化，产生了分段气管替代物。Xia等人使用山羊模型重复了这一方案。此外，有研究开发了无支架生物打印方法，使用多细胞类型的球体作为生物墨水，在F344大鼠中实现了功能性气管修复。

3.4 喉部再生

一项2022年试点研究在绵羊模型中调查了使用3D生物打印气道移植物进行重建手术的可行性，使用PCL支架和动物自身MSCs进行前喉气管重建（LTR）。一项2023年研究报告了使用挤出式生物打印机合成细胞填充的人工喉，结合PCL外部框架和含有兔软骨细胞的GelMA/甲基丙烯酸化透明质酸（GMHA）内部水凝胶生物墨水。另一项研究从雪貂中获取骨髓来源MSCs，使用GelMA生物墨水负载雪貂MSCs和PCL细丝开发了多材料3D生物打印支架，在雪貂前喉气管重建模型中显示平均气道体积扩张约8%。

3.5 眼部再生

Ulag等人探索了使用聚乙烯醇（PVA）和壳聚糖（CS）组合3D打印定制人工角膜基质替代物，人脂肪来源间充质干细胞（hADSCs）在构建体上存活30天。一项研究设计了穹顶形3D打印凸面角膜植入物，使用GelMA生物墨水和I型胶原，在兔板层角膜切除术模型中显示更快的上皮闭合和更少的瘢痕形成。Isaacson等人使用低粘度胶原基生物墨水负载人角膜角质细胞，采用自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（FRESH）技术制造角膜基质替代物原型。He等人使用数字光处理（DLP）3D打印方法和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）/GelMA生物墨水开发了3D打印双层角膜植入物。Wang等人开发了用透明质酸（HA）修饰GelMA的3D打印角膜支架，并描述了使用DLP 3D生物打印技术创建仿生双层缘植入物，在缘干细胞缺乏症（LSCD）模型中成功恢复角膜表面。

3.6 肌肉再生

一项2018年研究使用微纤化和浸出PVA/PCL组合的方法创建了微图案化PCL微纤维支柱，模仿骨骼肌细胞的排列和融合。Choi等人使用基于骨骼肌ECM的生物墨水，通过多头3D生物打印机沉积C2C12成肌细胞和聚己内酯（PεCL）提供机械支持。Capel等人使用熔融沉积建模（FDM）3D打印PLA模具构建人体骨骼肌组织。Distler等人创建了基于氧化海藻酸盐-明胶（ADA-GEL）的生物墨水，打印负载小鼠成肌细胞（C2C12）的支架，研究了喷嘴尺寸和挤出压力等参数对细胞取向、迁移和分化的影响。

3.7 神经再生

早期尝试包括通过电 hydrodynamic 喷射3D打印（EHD-jetting）打印基于PCL的3D多孔神经导引导管，125±15μm孔径的支架显示出最佳性能。一项2020年研究通过加入活血小板改进了神经导管，使用GelMA与PEGDA结合富血小板血浆（PRP）作为主要生物墨水，在大鼠坐骨神经缺损模型中加速了轴突再生。一项2023年研究创建了多尺度3D打印神经导引导管，使用可生物降解聚氨酯（PU）基质结合导电聚吡咯（PPy）纳米颗粒和排列的PCL微纤维，在大鼠坐骨神经损伤模型中显示出更大的神经再生和功能恢复。

1. 4.
   3D打印/3D生物打印的局限性

尽管具有潜力和令人鼓舞的结果，3D生物打印技术仍存在局限性，特别是在干细胞研究和临床转化领域。虽然3D生物打印结构确实显示出高水平的精度和准确性，但尚未建立来自临床前和临床研究的具体证据以确保生物打印结构的相容性和安全性。此外，生物墨水和3D生物打印结构的批量生产短缺仍然是当代再生医学面临的挑战，通常导致高生物打印成本。一些3D打印支架材料具有细胞毒性，其配方过程可能包含高毒性和致病性风险。复合材料复杂的几何形状也构成了生物打印中的重大挑战，同时需要处理多种材料并通过采用各种3D打印技术来后优化复合表面性质。最后，随着干细胞再生医学治疗的快速发展，打印器官和组织带来的社会伦理、法律合理性和监管问题也需要考虑。

1. 5.
   结论

总之，生物打印和3D打印是组织工程中的革命性发展，将该领域从静态被动支架的制造推进到动态负载细胞构建体的生产，这些构建体紧密模仿原始组织的结构和功能。这些技术结合活细胞、生物材料和生物活性因子，提供了对组织结构和细胞功能的精确控制，使得定制化再生疗法和先进疾病模型成为可能。随着生物墨水和打印技术的不断进步，在颅颌面区域及其他地方合成功能和患者特异性组织和器官的目标将变得可行。