《Drug Design, Development and Therapy》：Integrated Transcriptomic and Proteomic Analysis Elucidates the Mechanisms of Huperzine A Injection Against Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury
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背景：急性缺血性脑卒中血管再通后，脑缺血/再灌注损伤（CI/RI）会引发一系列级联病理生理事件，导致临床预后恶化，然而目前有效的治疗方案仍然有限。鉴于石杉碱甲（HupA）的神经保护潜力，研究者对HupA注射液（HAI，HupA的主要临床剂型）抗CI/RI的药效
背景：急性缺血性脑卒中血管再通后，脑缺血/再灌注损伤（CI/RI）会引发一系列级联病理生理事件，导致临床预后恶化，然而目前有效的治疗方案仍然有限。鉴于石杉碱甲（HupA）的神经保护潜力，研究者对HupA注射液（HAI，HupA的主要临床剂型）抗CI/RI的药效及其潜在分子基础进行了研究。方法：在CI/RI小鼠模型中，采用神经功能表现、运动能力、脑梗死体积、组织病理学改变及神经元凋亡等指标，综合评价两种剂量HAI的抗CI/RI效应。研究采用转录组学与蛋白质组学整合策略，以解析HAI抗CI/RI的关键机制，并进行实验验证。结果：与溶剂处理的CI/RI小鼠相比，HAI干预显著改善了神经行为缺陷，减小了梗死体积，减轻了组织病理学损伤，并抑制了神经元凋亡（P < 0.01）。转录组学与蛋白质组学的单独及整合分析均表明，补体与凝血级联以及炎症反应与HAI预防CI/RI的有益作用密切相关。确实，HAI治疗有效恢复了CI/RI小鼠受损皮层组织中补体与凝血级联关键靶点（包括C3、C5、C9、CFB、MASP2、F7、F10、F12和SERPINE1）在mRNA和蛋白水平上的失调表达（P < 0.05）。此外，该干预显著减弱了多种炎症介质（包括TLR2、TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL5、CXCL1、ICAM1、S100A9、LCN2、MMP8和MMP9）在mRNA和蛋白水平上的异常升高表达（P < 0.01）。结论：综上，数据表明HAI可能通过调节补体与凝血级联及协调炎症反应来发挥抗CI/RI作用。尽管仍需进一步研究，这些初步发现为加速HAI作为缺血性脑卒中抗CI/RI的新型神经保护剂的临床转化奠定了基础。
**整合转录组学与蛋白质组学解析石杉碱甲注射液抗脑缺血/再灌注损伤机制的研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
脑卒中在全球范围内是导致死亡和伤残调整生命年（DALYs）的主要原因，给社会和经济带来沉重负担。其中缺血性脑卒中占比最高。对于符合条件的急性缺血性脑卒中患者，再灌注治疗（静脉溶栓和血管内取栓）虽能改善早期预后，但再通后可能 paradoxically 诱发脑缺血/再灌注损伤（CI/RI），加重继发性脑损伤，延缓卒中后功能恢复。CI/RI的病理机制涉及兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、血脑屏障（BBB）破坏及多种程序性细胞死亡等多种相互关联的病理过程，其复杂性导致现有治疗手段效果有限。中药活性成分具有多靶点、多通路的药理特点，在缺血性脑卒中的干预中显示出神经保护潜力。石杉碱甲（HupA）是从蛇足石杉中提取的lycopodium生物碱，是一种强效可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可透过BBB。已有研究表明HupA在阿尔茨海默病、血管性痴呆、癫痫、脓毒症相关脑病、创伤性脑损伤及蛛网膜下腔出血等模型中具有神经保护作用。然而，HupA注射液（HAI）——2018年获批的HupA主要临床剂型——对CI/RI的保护作用及其分子机制尚未被系统阐明。为此，研究人员采用转录组学与蛋白质组学整合策略，在CI/RI小鼠模型中探究HAI的作用机制。
**二、关键技术与方法**
研究人员采用C57BL/6J小鼠制备大脑中动脉栓塞（MCAO）再灌注模型。实验分组包括假手术组、模型组、米诺环素（Min）阳性对照组、HAI低剂量组（0.1 mg/kg）及HAI高剂量组（0.2 mg/kg）。神经行为学评价采用改良神经功能缺损评分（mNSS）、旷场实验、转棒实验和抓力实验。TTC染色评估脑梗死体积，H&E染色观察组织病理学变化，TUNEL染色检测神经元凋亡。分子机制研究采用Illumina Novaseq 6000平台进行转录组测序（RNA-seq）和基于数据非依赖采集（DIA）的定量蛋白质组学技术（timsTOF HT质谱仪），并通过GO和KEGG富集分析、蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建及MCODE等生物信息学方法进行数据挖掘。验证实验采用RT-qPCR、ELISA和免疫荧光技术。样本来源于小鼠损伤皮层组织。
**三、研究结果**
**HAI干预改善了CI/RI小鼠的神经行为缺陷：** 与模型组相比，HAI不同剂量治疗均显著降低了mNSS评分，增加了旷场实验中的总运动距离和平均速度，降低了静止比率，延长了转棒实验中的跌落潜伏期和运动距离，并增强了前肢抓力，表明HAI可有效改善CI/RI引起的神经功能和运动功能障碍。
**HAI干预减轻了CI/RI小鼠的脑组织损伤：** TTC染色显示HAI治疗显著减小了脑梗死体积；H&E染色显示HAI减轻了皮层组织中的空泡化、细胞排列紊乱、神经元皱缩和核固缩等病理改变；TUNEL染色证实HAI抑制了神经元凋亡。
**转录组学分析揭示了HAI抗CI/RI的生物学机制：** RNA-seq共筛选出1898个差异表达基因（DEGs），其中下调1544个、上调354个。GO富集分析显示炎性反应居首位，并富集到TNF产生正向调节、IL-6产生正向调节、免疫应答、炎症反应正向调节及IL-8产生正向调节等炎症相关生物学过程。KEGG通路富集分析显示PI3K-Akt信号通路、补体与凝血级联、凋亡、MAPK信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路及IL-17信号通路等与炎症密切相关的通路被显著富集。
**蛋白质组学分析揭示了HAI抗CI/RI的分子机制：** DIA定量蛋白质组学共鉴定出757个差异表达蛋白（DEPs），其中下调345个、上调412个。GO富集分析显示DEPs显著富集于血凝、纤溶、补体激活、血小板活化及固有免疫应答等生物学过程。KEGG通路富集分析中补体与凝血级联排名第一，为后续验证提供了优先方向。
**转录组学与蛋白质组学整合分析：** 九象限图结合韦恩图共获得97个表达趋势一致的DEGs/DEPs（23个一致上调、74个一致下调）。GO和KEGG富集分析进一步证实补体与凝血级联和炎症反应是HAI抗CI/RI的核心机制。
**HAI调节CI/RI小鼠补体与凝血级联：** 通过构建DEGs和DEPs的PPI网络，结合拓扑算法筛选出12个核心靶点。RT-qPCR和ELISA验证显示，HAI治疗有效逆转了CI/RI小鼠皮层组织中C3、C5、C9、CFB、MASP2、F7、F10、F12及SERPINE1在mRNA和蛋白水平的异常升高；免疫荧光实验证实HAI降低了C3蛋白的表达。
**HAI调节CI/RI小鼠炎症网络：** 基于炎症相关通路的140个DEGs构建网络，经MCODE插件提取最显著子网络，结合多组学整合分析筛选出13个关键靶点。RT-qPCR和ELISA验证表明，HAI显著抑制了TLR2、TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL5、CXCL1、ICAM1、S100A9及LCN2在mRNA和蛋白水平的表达；免疫荧光实验证实HAI降低了MMP8和MMP9的表达。
**四、讨论与结论**
补体系统在CI/RI病理生理中通过经典途径、凝集素途径或替代途径被激活，三条通路汇聚于C3的裂解活化，产生的过敏毒素（C3a、C5a）和膜攻击复合物（MAC）放大炎症反应、破坏BBB并触发神经元死亡。凝血级联通过外源或内源途径启动，最终生成凝血酶，CI/RI引起的凝血酶浓度升高可导致BBB破坏、脑水肿、神经炎症和神经元死亡。补体与凝血系统之间存在广泛的交叉对话：补体系统不仅促进组织因子表达和血小板活化，活化的血小板和凝血因子也能激活补体系统。本研究中多组学数据联合表明补体与凝血级联是HAI抗CI/RI的关键通路。同时，补体和凝血级联的激活可协调CI/RI后的炎症网络，HAI通过多靶点抗炎作用恢复炎症介质的正常表达水平，构成了其抗CI/RI疗效的分子基础。研究存在的局限性包括：尚未采用单细胞和空间多组学技术深入解析机制；共表达与差异表达不一致的DEGs/DEPs有待深入研究；HAI疗效与其调节补体凝血级联和炎症反应之间的因果关系尚待确证；药物靶点鉴定方法可进一步明确HAI的精确靶点；单时间点设计难以反映完整时间历程。结论部分指出，本研究为HAI改善CI/RI后神经行为功能、减轻脑损伤提供了有说服力的证据，这些效应与其在补体和凝血级联中的多靶点调控作用以及炎症介质的调动有关，提示了潜在机制联系，但需进一步直接靶点验证以确认该关联。这些初步发现为加速将HAI作为缺血性脑卒中抗CI/RI的新型神经保护剂推向临床转化奠定了基础。该研究发表于《Drug Design, Development and Therapy》。
