二苯并[b,f]氮杂?-6(5H)-酮与苯并[b]吡啶并[2,3-f]氮杂?-5(6H)-酮：用于开发蛋白–蛋白相互作用抑制剂的有用骨架

《International Journal of Molecular Sciences》：Dibenzo[b,f]azocin-6(5H)-ones and Benzo[b]pyrido[2,3-f]azocin-5(6H)-ones: Useful Scaffolds for Development of Protein–Protein Interaction Inhibitors

　　

通过小分子调控蛋白–蛋白相互作用（protein–protein interactions，PPIs）是药物发现中的重要策略。然而，由于PPI界面本身的性质，该方法的实际实施仍是药物化学中的高难度问题。研究人员此前开发了二苯并[b,e]氮杂?-6(6H)-酮骨架，本报告通过对该骨架进行同系化（homologation），开发出一类新型PEX14–PEX5 PPI抑制剂。八元环形成的合成挑战促使研究人员开发了具有6+8+6三环体系的新型PEX14抑制剂。所得类似物被测试了破坏PEX5-TbPEX14 PPI的能力以及对T. brucei原虫的体外活性。总体而言，所开发的骨架不仅可作为有前景的杀锥虫TbPEX14配体替代结构，也可用于设计由相似拓扑疏水结合口袋介导的其他PPI抑制剂。

研究背景方面，蛋白–蛋白相互作用（protein–protein interactions，PPIs）参与凋亡、分化、代谢和胞内运输等关键过程，因此选择性调控蛋白复合形成是抗击人类疾病和解析细胞过程的重要策略。但与酶和受体等“经典”药物靶点不同，PPI界面通常具有大而平坦、溶剂暴露的结合面，结合口袋浅且分散，导致化合物设计和ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质优化极难，故PPI调控被称为药物化学中的“高悬果实”。在锥虫（Trypanosoma）相关致命疾病如人类非洲锥虫病（HAT）和查加斯病中，PEX14–PEX5 PPI负责糖体（glycosome）生物发生；研究人员此前已发现该类PPI的首批抑制剂，其结合依赖于PEX14表面由PEX5的WxxxF重复序列识别的Trp和Phe疏水口袋，以及F16–F33堆叠苯环形成的双芳香桥。已有6+7+6三环类抑制剂可模拟WxxxF结合模式，但研究人员希望知道：将中心七元环同系化为更柔性的八元环，形成6+8+6体系，是否能成为另一类可行PPI界面干预分子。

本研究由研究人员在《International Journal of Molecular Sciences》报道，核心是用同系化策略把已有二苯并[b,e]氮杂?-6(6H)-酮等6+7+6骨架扩展为二苯并[b,f]氮杂?-6(5H)-酮与苯并[b]吡啶并[2,3-f]氮杂?-5(6H)-酮两类6+8+6骨架，并验证其阻断PEX14–PEX5 PPI及杀锥虫活性。

主要关键技术方法包括：分子对接（docking）用于预测6+8+6配体与TbPEX14 N端结构域（NTD）的结合姿态；八元环构建采用Beckmann重排以及TBD（1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯）催化的分子内酰胺化；生物活性评价采用AlphaScreen assay测定PEX5–TbPEX14 PPI破坏效力，并以T. brucei血流型作为体外杀锥虫模型、HepG2细胞作细胞毒性对照；计算研究采用量子力学（QM）结合能计算及能量分解与去卷积分析（EDDA）解释构效关系。样本方面为T. brucei bloodstream form Lister 427与人HepG2肝细胞系。

2.1 化合物设计（Compound Design）：研究人员将化合物9对接至TbPEX14，并与化合物7姿态比较，发现两者高度相似且符合化合物4对TcPEX14的晶体学结合模式，从而支持合成6+8+6骨架进行实验验证。

2.2 合成（Synthesis）：二苯并系列9和11通过二苯并环庚酮肟的Beckmann重排构建八元环，再经硝化、烷基化、还原及EDC酰胺化或Petasis borono–Mannich反应得到；苯并吡啶系列10和12因不对称酮前体区域异构风险及可及性差，放弃Beckmann路线，改由氯代烟酸酯与邻硝基苯甲酸衍生物经C-烷基化、还原、Wittig反应和TBD触发分子内酰胺化构建8元环，其中乙酯27在TBD条件下闭环收率显著优于甲酯26，且TBD被认为通过氮原子酰胺化及分子内氢键实现底物预取向。

2.3 生物学评价（Biological Evaluation）：在AlphaScreen中，6+7+6到6+8+6转换未带来显著活性变化；化合物9与7等效，化合物10因吡啶替代苯而PPI抑制弱，化合物11较9更强，化合物12无活性说明氮杂类似物结合能力丧失与Trp口袋投射基团无关。细胞实验中9–11与母核6+7+6类似，10和11具单数字μM级杀锥虫IC₅₀，仅11对HepG2有边缘细胞毒性；杀锥虫EC₅₀低于PPI抑制浓度，源于糖体蛋白错误定位导致ATP耗竭。

2.4 计算研究（Computational Studies）：QM结合能与实验EC₅₀有合理相关；EDDA显示吡啶引入产生静电、极化与色散不利；6+8+6静电略优，但6+7+6因脂溶作用（lipophilic interactions）和形状互补（以电子密度重叠REP表征）更强而结合更优，八元环使配体稍离蛋白表面，降低形状互补与色散稳定，故更大环未转化为更强吸引。

讨论部分指出，6+7+6系列凭借更优形状互补和脂溶作用占优；6+8+6虽有更强静电作用但表面互补下降，可作为替代骨架但无显著优势，其他如6+8+5也难改善互补，后续应优化与E16、D20、R22、K38等残基的极性接触及溶剂壳相互作用。

结论部分翻译：数十年来，用小分子靶向PPI一直是药物开发中的诱人策略；但由于蛋白结合界面结构特征，该策略极难落地。PEX14–PEX5 PPI具有该类靶点的典型挑战，而研究人员此前的结构药物发现给出了多类抑制剂，其中6+7+6三环骨架可通过独特方式结合PEX14 NTD疏水口袋及分隔口袋的双芳香Phe–Phe基序。本报告通过插入一个-CH₂-单元对该化学型进行同系化，八元环合成化学促使研究人员获得二苯并[b,f]氮杂?-6(5H)-酮和苯并[b]吡啶并[2,3-f]氮杂?-5(6H)-酮骨架。正如预期，6+8+6原型衍生物9、10、11在破坏TbPEX14–PEX5复合形成及对布氏锥虫（Trypanosoma brucei）细胞活性上与此前6+7+6抑制剂无显著差异，从而提供了靶向该PPI的新替代骨架。这些发现不仅是开发新型抗寄生虫化合物的起点，也可用于设计由类似PEX14–PEX5复合体疏水口袋拓扑所介导的其他PPI抑制剂。