人抗汉坦病毒（Hantaan virus, HTNV）抗体KJJ4的制备与表征

《International Journal of Molecular Sciences》：Generation and Characterization of the Human Anti-HTNV Antibody KJJ4

　　

汉坦病毒（HTNV）是中国肾综合征出血热（HFRS）的主要病原，目前无特异性抗病毒治疗。中和抗体（NAbs）是具前景的策略，但现有抗HTNV中和抗体多为异源，存在免疫原性风险。研究人员从已建立的人源抗HTNV噬菌体展示文库中获得两株全人源抗体并表征。KJJ3为源自克隆3–12的VL-VL串联抗体，对灭活HTNV结合弱，中和活性低（IC50=27.12 μg/mL）。KJJ4为源自克隆4–19、带S108P铰链突变以防Fab臂交换的工程化IgG4抗体，可剂量依赖结合灭活HTNV抗原及重组糖蛋白Gn（残基19–371），仅弱结合Gc。表面等离子共振（SPR）显示其对单体Gn19–371的缔合速率常数4.70×103 M?1s?1、解离速率常数3.06×10?3 s?1、平衡解离常数650 nM。Vero E6焦点减少微量中和试验里，KJJ4体外中和HTNV的IC50为2.879 μg/mL。上述数据确立KJJ4为具有实验定义体外结合与中和活性的全人源抗HTNV抗体，值得在HTNV感染动物模型中进一步评价。

《International Journal of Molecular Sciences》刊发的该文围绕中国HFRS主要病原汉坦病毒（Hantaan virus, HTNV）展开。HFRS全球负担中中国占比超90%，临床以支持治疗为主，灭活疫苗保护持久性有限，无广泛获批的特异性抗病毒药。中和抗体（Neutralizing antibodies, NAbs）可阻断病毒进入，但多数高活性抗HTNV中和抗体为异源来源，有宿主抗抗体免疫原性风险；全人源NAbs免疫原性低、临床安全性高，因此从人源噬菌体文库筛选并工程化全人源抗HTNV抗体具备明确治疗转化价值。

研究人员在前期构建人抗HTNV噬菌体抗体文库并初筛出具中和活性的Fab 3–12与Fab 4–19基础上，将3–12改为V_L-V_L串联抗体KJJ3，将4–19改为带S108P突变的IgG4抗体KJJ4，用HEK293真核系统表达纯化，经ELISA、微量中和、SPR等证明KJJ4结合Gn并体外中和HTNV，而KJJ3活性弱。该研究为HTNV相关HFRS提供了可进一步临床前开发的全人源单克隆抗体候选。

主要关键技术方法：研究人员使用Vero E6细胞与HTNV 76–118毒株，从自有人源抗HTNV噬菌体展示文库出发，经基因合成与HEK293真核瞬时转染表达、亲和纯化获得抗体；以灭活HTNV抗原和重组Gn_19–371/Gc蛋白作靶标，用酶联免疫吸附试验（ELISA）评价结合，用Vero E6焦点减少微量中和试验评中和，用表面等离子共振（SPR）定动力学参数；样本来源为前期文库克隆及第四军医大学提供的细胞与病毒。

2.1 KJJ3与KJJ4抗体的构建及生化表征：研究人员通过PCR扩增、克隆测序验证构建pPG3-L-KJJ3、pPG3-L-KJJ4-LC、pPG3-L-KJJ4-HC，转染HEK293后获纯化抗体。SDS-PAGE显示KJJ3非还原与还原均为约25 kDa，KJJ4非还原约150 kDa、还原分25 kDa轻链与50 kDa重链；ImageJ算得纯度94.8%与99.8%，BCA得浓度2.3 mg/mL与1.02 mg/mL，证明正确装配与高纯度。

2.2 KJJ4结合HTNV抗原并具体外中和活性：ELISA中KJJ3对灭活HTNV结合弱，KJJ4在≥160 ng/mL时P/N达4.4；微量中和中KJJ3 IC₅₀=27.12 μg/mL，KJJ4剂量依赖抑制感染、IC₅₀=2.879 μg/mL，故后续聚焦KJJ4。

2.3 KJJ4对HTNV-Gn的特异性结合与动力学：KJJ4弱结合Gc、剂量依赖结合Gn_19–371；SPR呈可逆结合，ka=4.70×10³ M^?1s^?1、kd=3.06×10^?3 s^?1、K_D=6.50×10^?7 M（650 nM），Rmax约14.9 RU，属中等亲和力特异性可逆结合。

讨论部分指出：HFRS在中国负担重，支持治疗与利巴韦林效果有限；KJJ4全人源IgG4（S108P）单体Gn亲和力中等但体外中和达低微克级，单体亲和力不能完全预测效力，病毒表面（Gn/Gc）₄多价晶格上的二价亲合力可解释SPR与中和浓度差。KJJ4表位大概率在Gn头（受体结合域），但是否与AH100、HTN-Gn1重叠未明。IgG4-S108P可能弱化补体激活与经FcγRIIb调控炎症，但未见实验验证。相较AH100、ADI-42898、SAB-163，KJJ4缺表位图、广度、药代与体内疗效数据。局限为仅体外、未绘图谱、未测Fc效应、未测异源汉坦病毒交叉中和。未来应做表位作图、仓鼠攻毒、IgG1对照、PUUV/Seoul/Dobrava交叉及鸡尾酒组合。

结论部分译文：本研究制备并实验表征了靶向汉坦病毒糖蛋白Gn的全人源IgG4（S108P）抗体KJJ4。KJJ4以650 nM的K_D结合重组Gn_19–371，并以2.879 μg/mL的IC₅₀中和HTNV对Vero E6细胞的感染；而V_L-V_L串联抗体KJJ3仅具极低中和活性（IC₅₀=27.12 μg/mL，约弱于KJJ4九倍）。后续关键步骤为实验性的：Gn–KJJ4界面表位作图与诱变、对其他致病汉坦病毒的交叉反应检测，以及HTNV动物模型疗效评价。这些数据将KJJ4定位为抗HTNV相关HFRS的进一步临床前开发候选。