TLR4：溶血性尿毒症综合征实验发病机制中的潜在治疗靶点

《International Journal of Molecular Sciences》：TLR4: A Potential Therapeutic Target in the Experimental Pathogenesis of Hemolytic-Uremic Syndrome

　　

儿童感染产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）可引起血性腹泻及危及生命的溶血性尿毒症综合征（hemolytic-uremic syndrome，HUS）。肠道中STEC产生的Stx2释放入血，通过两种不同的受体与循环细胞（单核细胞、中性粒细胞和血小板）相互作用：Gb₃Cer（三己糖酰基鞘脂醇，globotriaosylceramide）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）。因此，血细胞形成白细胞/血小板聚集体，并释放含Stx2的致病性细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），这些EVs通过损伤肾脏，诱导从血性腹泻向HUS的转变。研究人员将人血液与Stx2共孵育，以诱导中性粒细胞/血小板及单纯血小板聚集体的形成（在May–Grünwald Giemsa染色血涂片中观察），以及致病性血细胞来源EVs的产生（通过体积排阻色谱或差速离心分离），这些EVs对Vero细胞具有毒性（通过活力测定评估）。在存在抗TLR4单克隆抗体（anti-TLR4）的情况下，与单独Stx2处理相比，中性粒细胞/血小板及单纯血小板聚集体的形成显著减少。此外，anti-TLR4显著降低了Stx2产生的致病性血细胞来源EVs的总量（通过纳米颗粒追踪分析检测），这些EVs对Vero细胞的毒性低于单独Stx2产生的EVs。在HUS实验发病过程中对Stx2-TLR4轴的干扰提供了概念验证性证据，支持TLR4作为潜在治疗靶点。

溶血性尿毒症综合征（hemolytic-uremic syndrome，HUS）是一种罕见且危险的病理状态，其典型形式由产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）感染引起，该菌在肠道定植导致腹痛、呕吐和常为出血性的腹泻。在前驱肠道期，非侵袭性STEC释放的毒素进入血液，引发一系列最终形成HUS三联征（血小板减少、微血管病性溶血性贫血和急性肾衰竭）的事件。HUS被认为是3岁以下儿童急性肾衰竭的主要原因。与HUS最相关的毒素类型Stx2可被保护性血液因子人血清淀粉样蛋白P成分（human serum amyloid P component，HuSAP）中和，因此必须寻找不同的投递途径。Stx2通过中性鞘糖脂Gb₃Cer和蛋白性Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）两种受体与血小板、单核细胞和中性粒细胞结合。这些多重相互作用刺激循环细胞产生双重反应：形成血小板-白细胞聚集体，以及释放含Stx2和其他毒力因子的大细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。大致病性EVs在STEC感染儿童发展为HUS前一天即可在血液中检出，因此EV相关Stx2被认为是HUS发病中最危险的毒素形式。当Stx2的A链与EV表面TLR4结合时，与Gb₃Cer相互作用的B五聚体得以暴露，从而引导致病性EVs朝向靶细胞。因此，TLR4成为聚焦治疗干预的良好候选靶点。本研究旨在通过离体人血液模型，验证在HUS实验发病过程中靶向TLR4是否能减少聚集体和致病性EVs的产生，从而保护靶细胞。研究人员证明，靶向TLR4可强烈减少白细胞/血小板及单纯血小板聚集体的形成以及大致病性含Stx2 EVs的释放，保护表达Gb₃Cer的靶细胞免于中毒。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

研究使用来自意大利博洛尼亚Maggiore医院Emilia-Romagna区域血液中心的三名健康成人供者血液样本。主要技术包括：Stx2a处理全血建立实验性HUS离体模型；May–Grünwald Giemsa染色血涂片光学显微镜计数聚集体；qEV original 70 nm体积排阻色谱柱或差速离心（10,400×–20,800×g）分离EVs；纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）测定EVs大小与数量；Gb₃Cer表达Vero细胞活力测定评估EVs毒性；使用小鼠抗TLR4单克隆抗体3C3（10 μg/mL）靶向TLR4。

2.1 用特异性抗体靶向TLR4损害Stx2a诱导的白细胞/血小板及单纯血小板聚集体形成
人血液与Stx2a（