内溶素 LysSte134_1 降低感染伤口体内葡萄球菌菌载量

《International Journal of Molecular Sciences》：Endolysin LysSte134_1 Reduces Staphylococcus Bacterial Load in Infected Wounds In Vivo

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于ESKAPE病原体，以其逃避抗菌治疗的能力为特征，其与表皮葡萄球菌（S. epidermidis）同为伤口感染的主要革兰阳性病因。甲氧西林耐药与万古霉素耐药菌株的出现进一步限制常规抗生素治疗。研究人员将葡萄球菌内溶素 LysSte134_1 进行重组表达，通过酶谱法确认其正确折叠，并证实其对浮游状态的金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌具有裂解活性。LysSte134_1 与10% 1,3-丙二醇及 Zn2+ 联用，相较单独 Zn2+ 条件在两物种中均增加 CFU 减少量。在小鼠伤口模型中，局部应用 LysSte134_1 显著降低伤口组织菌载量，对 MRSE 实现2–3个对数减少，对表皮葡萄球菌降至检测限以下。治疗伴随外周白细胞计数正常化，以及血清细胞因子谱由 IL-6、IL-17 和 IL-10 升高的持续促炎状态向接近非感染对照组水平转变。结果表明 LysSte134_1 有望作为局部抗菌制剂组分，并支持在葡萄球菌伤口感染模型中进一步研究。

研究背景方面，金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌是伤口感染中最常检出的葡萄球菌种。金黄色葡萄球菌属ESKAPE组，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）与万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）被WHO列为新抗菌药高优先靶点；表皮葡萄球菌虽不在ESKAPEE名单中，但多重耐药医院分离株在植入物相关和医疗相关伤口感染中临床负担可与金黄色葡萄球菌相当。慢性不愈合伤口定义为标准治疗1–3个月未达面积减少至少50%，给医疗系统造成沉重负担；组织菌载量高于10⁵ CFU/g与愈合延迟和抗菌耐受相关。金黄色葡萄球菌通过MSCRAMM介导黏附、生物膜成熟、α-溶血素与Panton–Valentine杀白细胞素等细胞毒素，以及蛋白A和凝固酶免疫逃逸致病，agr群体感应系统调控这些因子；表皮葡萄球菌主要毒力为icaADBC编码的胞间多糖黏附素（PIA/PNAG）等介导的生物膜。现行标准治疗受获得性耐药和生物膜耐受影响，生物膜相关感染中抗生素常仅短暂抑制菌量而不能根除。噬菌体编码内溶素是作用于肽聚糖的肽聚糖水解酶，可外源裂解革兰阳性菌，具有窄谱、快速杀菌、低耐药选择压力及皮肤感染临床前疗效，但伤口表面存在蛋白酶、pH与离子强度变化、渗液稀释和干燥等不利因素，金属依赖内溶素还需催化阳离子在位。1,3-丙二醇可作保湿剂、蛋白稳定剂和中等浓度抗菌剂。LysSte134_1是噬菌体vB_SepP_134的内溶素，为Zn²⁺依赖N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，既往已证体外破坏金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌生物膜，但配方后体内行为未明。该研究即在此基础上评价其局部配方在小鼠伤口感染模型中的体内表现。

主要关键技术方法方面，样本来自新西伯利亚ICBFM SB RAS的CEMTC临床分离株收藏，含MRSA CEMTC 675、VRSA CEMTC 1685、表皮葡萄球菌CEMTC 2058及其他凝固酶阴性葡萄球菌。研究人员用含纯化肽聚糖的SDS-PAGE进行酶谱分析评估底物水解；用浮游菌CFU计数杀伤实验评价1,3-丙二醇与ZnCl₂对LysSte134_1活性的影响；用人和小鼠红细胞溶血实验评估直接溶血；建立雌性BALB/c小鼠化脓性伤口感染模型，在感染形成开放化脓病灶后每日局部给药，于第14天取伤口组织匀浆做CFU计数，并在治疗后第2、4天采血做血常规与ELISA测TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17，以伤口长宽乘积估测创面面积。

研究结果如下。2.1 LysSte134_1对S. simulans、S. auricularis、S. caprae、S. capitis的酶谱活性：通过含各葡萄球菌种纯化肽聚糖的酶谱法，研究人员发现LysSte134_1高效水解金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和S. capitis肽聚糖，对S. simulans、S. auricularis、S. caprae有弱活性，对S. warneri、S. felis、S. hominis等无可见活性，说明其靶谱以金葡和表葡为主并可及部分凝固酶阴性葡萄球菌。2.2 LysSte134_1抗葡萄球菌浮游细胞体外活性：以20 μg/mL LysSte134_1处理金葡CEMTC 1685与表葡CEMTC 2058，基础可致40倍CFU减少；加入ZnCl₂后活性增强，10 μM时达5000倍减少；再加10% 1,3-丙二醇进一步增加一个数量级以上，表葡CEMTC 2058降至活菌检测限以下，说明Zn²⁺与1,3-丙二醇可协同提升酰胺酶功能。2.3 LysSte134_1溶血活性：在100 μg/mL起七个两倍稀释、1 h和6 h条件下用人和小鼠红细胞检测，各浓度与时间点的溶血均处阴性对照水平，远低1% Tween-20阳性对照，表明在测试条件下LysSte134_1无直接溶血活性。2.4 LysSte134_1小鼠伤口感染模型体内抗菌活性：将动物分为完整、非感染伤口、未治疗、0.9% NaCl、无内溶素配方、LysSte134_1配方六组，感染MRSA或表葡后局部用含1 mg/mL LysSte134_1的1,3-丙二醇配方。金葡感染组菌量较未治疗降500±32倍、较无内溶素配方降2000±84倍；表葡感染组LysSte134_1组无可培养菌落，未治疗与无内溶素配方组仍高菌量。体重方面，未治疗组感染后减重持续约6天，LysSte134_1组治疗后1天内停止减重并稳步回升。血常规显示未治疗组第2天白细胞增多、第4天总白细胞降至各组最低，符合持续菌载下白细胞消耗；LysSte134_1组第4天白细胞接近完整动物。细胞因子方面，未治疗组第2天IL-6与IL-17升高，第4天IL-6进一步升高并出现IL-10；LysSte134_1组第2天IL-17不可检，第4天IL-6降至非感染伤口水平、IL-10不可检、IL-17中度可检，提示全身炎症随菌量清除而缓解。创面面积在观察起止日之间各伤口组均缩小，非感染伤口组缩减最大，LysSte134_1组缩减34.1%且显著优于无内溶素配方、NaCl与未治疗组，但仅表葡模型中对未治疗组达显著。

讨论部分总结：研究人员指出慢性伤口多重耐药与生物膜使常规治疗失效，内溶素可裂解浮游与生物膜细胞而成为有前景抗菌剂。LysSte134_1在更广凝固酶阴性葡萄球菌底物上有活性，无检测范围内人/鼠红细胞溶血；局部1,3-丙二醇配方可降低MRSA菌载并将表葡降至检测限以下，伴体重恢复。与CHAP结构域内溶素不同，LysSte134_1具Zn²⁺依赖Amidase_2（NALAA-2）与SH3样细胞壁结合域，对金葡加表葡及部分CNS的属级活性在混合感染中有潜在价值，但是否优于窄谱维持共生菌群的方案取决于感染是单微生还是多微生。作者明确局限：单小鼠模型、单/少临床株、单微生模型未涵盖铜绿假单胞菌和肠杆菌目、未做再上皮化与胶原沉积等组织学、细胞因子板仅四种、体内未见Zn²⁺或丙二醇单独/联合全因子组、未与莫匹罗星或夫西地酸等标准外用药直接比较、未测角质形成细胞/成纤维细胞等皮肤驻留细胞毒性、n=6的二次终点统计力有限、稳定性与药代毒理未做。

研究结论部分翻译：总体而言，这些发现支持将Zn²⁺依赖内溶素LysSte134_1与1,3-丙二醇配制的局部方案，作为葡萄球菌伤口感染的一种组成部分开展进一步研究。其对浮游和生物膜相关葡萄球菌的活性、种特异性、测试条件下无 detectable 溶血、伤口菌载降低，以及伴随的外周白细胞计数和血清细胞因子浓度变化，值得额外临床前评价。未来研究应包括与标准局部抗菌药直接比较、伤口修复的组织病理学评估、多微生模型评价、更广临床分离株面板检测、皮肤驻留细胞毒性评估，以及全面的局部与全身毒理学和药代动力学表征。

该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。