《International Journal of Molecular Sciences》：Tonabersat Blocks Gap Junctions and Alleviates Thermal Pain Behavior in Mice
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间隙连接（Gap Junctions，GJs）是使离子和小分子在细胞间交换的通道，并被牵涉到神经病理性疼痛的发生与维持中。损伤诱导的感觉神经节内胶质细胞活化伴随GJ介导的耦合增强，进而提高神经元兴奋性，参与痛信号传递。Tonabersat（TON）曾被推测作为
间隙连接（Gap Junctions，GJs）是使离子和小分子在细胞间交换的通道，并被牵涉到神经病理性疼痛的发生与维持中。损伤诱导的感觉神经节内胶质细胞活化伴随GJ介导的耦合增强，进而提高神经元兴奋性，参与痛信号传递。Tonabersat（TON）曾被推测作为GJ阻断剂具有镇痛作用，但该说法存在争议。研究人员检测了TON是否阻断GJ，以及其在小鼠痛模型中是否影响痛行为。GJ耦合通过小鼠肝脏和三叉神经节（trigeminal ganglia，TG）的染料偶联法检测。痛行为在化疗诱导痛小鼠模型中用von Frey纤毛（触觉敏感性）、丙酮法（冷敏感性）和热板法（热敏感性）检测。胞内染料注射显示，TON与GJ阻断剂carbenoxolone（CBX，均为50 μM）分别抑制GJ耦合70%和82%。在三叉神经节中，TON与CBX分别抑制GJ耦合74%和77%。TON选择性降低热和冷超敏，但不影响机械阈值；CBX降低所有超敏类型。未观察到性别差异。研究人员得出结论：TON与CBX均降低耦合，提示其具有影响GJ介导耦合的潜力；行为学上TON对热超敏具有选择性作用，但机制不明；CBX对耦合的抑制略强于TON。这些发现提示GJ参与痛通路，并凸显探索其他镇痛药是否通过阻断GJ起效的必要性。
研究背景方面，慢性疼痛是全球性健康难题，成人终生患病率约12.7%至33.7%，现有镇痛药疗效有限且可能有严重不良反应。痛通路中除化学突触外还存在电突触即间隙连接（Gap Junctions，GJs），由两侧细胞膜上的连接子（connexon）对接形成，每个连接子由6个连接蛋白（connexin，Cx）组成，神经系统中常见Cx43、Cx36和Cx32。周围神经系统里卫星胶质细胞（satellite glial cells，SGCs）和施万细胞可通过GJ相互耦合，神经损伤或炎症会增强SGC-SGC、SGC-神经元及神经元-神经元耦合。已有研究提示阻断GJ可缓解动物痛行为，但尚无FDA批准的以阻断GJ为机制的镇痛药；TON曾作为偏头痛候选药进入临床，其机制被称可阻断GJ，也有研究称其不阻断GJ而只阻断Cx43半通道（hemichannel），因此TON是否确为GJ阻断剂及其镇痛特征仍需直接验证。
论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。研究人员以小鼠为模型，在肝脏和TG开展染料偶联实验，并在奥沙利铂诱导神经病理性痛模型中开展机械、冷、热痛行为学评价，比较TON与CBX的作用，最终证明TON是广义GJ阻断剂，并可选择性缓解热与冷超敏。
主要关键技术方法如下：样本来自BALB/c小鼠，部分补充C57BL/6小鼠，雌雄均用；TG实验采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理小鼠以增强SGC耦合。技术包括胞内显微注射Lucifer Yellow的染料偶联法、以耦合发生率与染色面积量化GJ功能、奥沙利铂腹腔注射建立化疗痛模型、von Frey纤毛测机械阈值、丙酮法测冷超敏、52±2 °C热板法测热撤回潜伏期，以及非参数Kruskal–Wallis检验和单因素ANOVA统计。
2.1 Tonabersat Inhibits Gap Junctional Coupling in Mouse Liver：研究人员在小鼠肝脏注射Lucifer Yellow，对照组约20至30个肝细胞被偶联、扩散圆直径约60 μm；加入TON（50 μM）后耦合发生率降70%，染色面积也明显减少，0.05% DMSO无影响，雄鼠与雌鼠无差异，洗脱30至40 min可逆转。CBX（50 μM）同样显著阻断耦合。C57BL/6结果与BALB/c一致，说明TON在肝脏中可阻断以Cx32为主的GJ，且该作用不依赖品系。
2.2 Tonabersat Inhibits Gap Junctional Coupling in the Trigeminal Ganglia：TG中主导GJ蛋白为Cx43。LPS处理小鼠后SGC间染料偶联增强；在灌流液中加TON（50 μM）后，注射SGC的染料仅局限于单个神经元周围SGC，耦合被显著抑制，CBX（100 μM）结果相似。研究人员由此认为TON不是Cx32选择性阻断剂，而是对Cx43也同样有效的广义GJ阻断剂。
2.3 Tonabersat Reduces Thermal Hypersensitivity：奥沙利铂小鼠出现机械、冷、热三类超敏。腹腔给TON（50 mg/kg）后，雄鼠与雌鼠的机械阈值均无显著改善，但冷反应时间缩短、热撤回潜伏期延长，即冷与热超敏被缓解；CBX（50 mg/kg）则同时改善机械、冷、热三类超敏。结果表明TON具有镇痛作用，但是选择性作用于温度觉通路而非机械痛通路。
讨论部分总结：研究人员指出，scrape loading与胞内注射结果不一致可能源于方法损伤性、细胞模型与新鲜组织差异、以及CBX浓度不同；这并不排除TON也可阻断hemichannel，但hemichannel不连接细胞、不等于GJ。TON对冷和热有效而对机械无效，类似吗啡或利多卡因在人类痛模型中的模态选择性，可能与TON、CBX对感觉神经元TRPV1（热敏）和TRPM8（冷敏）等瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道作用不同有关。CBX在染料偶联上强于TON，而机械痛缓解更需要强GJ阻断力，说明机械痛通路对GJ阻断较不敏感。GJ在多种痛模型中上调，尤其SGC间耦合增强，使GJ成为镇痛靶点；TON脂溶性强可能入中枢，CBX不跨血脑屏障，因此TON作用位点还需进一步界定。
结论部分翻译：研究人员证实TON是一种广义GJ阻断剂，并可缓解热痛而非机械痛。可提出TON及其他GJ阻断剂具有作为镇痛药的潜力。
