硝呋齐特类似物的综合生物学评价：血清蛋白结合、细胞毒性与抗菌活性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：ADCK1 Regulates Mitochondrial Bioenergetics in Hepatocellular Carcinoma In Vitro

　　

多重耐药菌的全球性传播以及肿瘤疾病负担的不断上升，对人类健康和全球公共卫生医疗系统构成了日益严重的威胁。目前，人们正在大力开展新药发现以及现有药物的重新定位或再利用研究。近年来，于20世纪60年代末引入临床实践的硝呋齐特（nifuroxazide）因其抗肿瘤潜力而受到广泛关注。然而，其肠道吸收不良限制了其作为全身性抗肿瘤药物的适用性，这一问题可通过化学修饰加以解决。在本研究中，研究人员评估了11种硝呋齐特类似物，这些类似物对五元环（呋喃被噻吩替代）和六元芳香环（取代基位置和性质的改变）均进行了系统性修饰。在HCT116和HEK293细胞系上进行的MTT细胞毒性实验显示，2-吡啶羧酸的5-硝基糠叉肼和2-吡啶羧酸的5-硝基噻吩-2-基肼对肿瘤细胞具有选择性毒性，同时对非肿瘤细胞的毒性显著较低，表明其具有在更复杂的生物学模型中进一步研究的潜力。抗菌活性测试确定3-羟基苯甲酸的5-硝基糠叉肼和3-吡啶羧酸的5-硝基糠叉肼具有特别强的抗菌效力。

**论文解读：硝呋齐特类似物的综合生物学评价**

**研究背景与目的**

多重耐药微生物的持续扩散已成为全球公共卫生的重大威胁。2021年，估计有471万例死亡与细菌抗生素耐药性相关，预计到2050年这一数字将上升至822万。为应对这一挑战，各国纷纷实施遏制 antimicrobial resistance（抗菌药物耐药性，AMR）的战略计划，其中新药发现、药物再利用及现有药物的结构修饰是颇具前景的策略。硝呋齐特（nifuroxazide）于1966年获得美国专利，广泛用于治疗急性腹泻、阴道炎以及沙眼衣原体、支原体和念珠菌引起的感染。研究表明，硝呋齐特具有广谱抗菌活性、抗肿瘤潜力及心脏保护作用。硝呋齐特通过抑制JAK2/TYK2介导的STAT3激活来发挥抗肿瘤作用，并可通过PPAR-γ信号激活和抑制NLRP3/STAT3通路来减轻5-氟尿嘧啶诱导的心脏毒性。此外，硝呋齐特与利拉鲁肽联用可通过调节JAK2/STAT3/NF-κB信号通路增强抗脓毒症急性肺损伤效果；与低剂量瑞戈非尼联用可抑制肝癌细胞活性并诱导凋亡。然而，硝呋齐特的口服吸收率仅为10%至20%，大部分药物滞留于肠道腔内并以原形排出，这严重制约了其作为全身性抗肿瘤药物的应用。既往对硝呋齐特类似物的研究较为零散，缺乏在同一研究中对整个化合物系列的系统比较评估。本研究旨在通过系统性评价11种硝呋齐特类似物的血清蛋白结合亲和力、对肿瘤及非肿瘤细胞系的细胞毒性以及抗菌活性，建立较为完整的构效关系（structure-activity relationship，SAR）框架，为基于硝呋齐特的治疗药物优化提供依据。

**技术方法概述**

研究人员通过回流5-硝基糠醛或5-硝基-2-噻吩甲醛与相应酰肼合成了11种硝呋齐特衍生物（化合物1-12），采用核磁共振波谱（NMR）、红外光谱和质谱确认结构。研究使用荧光光谱滴定法测定了化合物与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、牛γ-球蛋白（BGG）和人γ-球蛋白（HGG）的结合常数（pH 6.86，298.2 K）。细胞毒性采用MTT法在人结肠腺癌细胞HCT116和人胚肾细胞HEK293T上进行评估。抗菌活性采用琼脂孔扩散法测定化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抑制效果。

**研究结果**

**2.1 合成化合物1-12的NMR谱学特征**

所有化合物均以较高产率合成，并通过1H NMR、13C NMR、IR和质谱确认了结构和纯度。NMR数据揭示了几个重要结构特征：—NH—桥接质子的位置不受五元环性质影响，但与六元芳香环结构相关；杂氮原子的引入导致—NH—共振信号明显向低场移动，表明形成了较弱的分子内氢键（NH···N_heter）；邻位羟基衍生物中—OH质子出现显著低场位移，证实了OH···O_carbonyl氢键的形成；噻吩衍生物相较于呋喃衍生物的C=O碳共振信号轻微向低场移动，归因于噻吩更大的芳香性。

**2.2 化合物1-12与血清白蛋白和γ-球蛋白的结合平衡**

荧光猝灭实验表明，所有肼类化合物的加入均导致蛋白质内源荧光猝灭，提示配体结合改变了荧光氨基酸残基的微环境。通过KEV软件处理实验数据，研究人员确定最可能的化学计量比为1:1（P:L），并计算了条件结合常数。结果表明，无论配体结构或蛋白质来源如何，结合常数的变化范围较窄（log K′ = 4.4至5.6），平均值为log K′ = 5.0 ± 0.3，说明所有配体对所有受试蛋白质具有相似的亲和力。白蛋白在血液中浓度较高（约0.6 mM），这种强结合力意味着药物与蛋白质的结合率可达90%至100%，对硝呋齐特的再利用（如静脉给药）具有重要的药代动力学意义。

**2.3 化合物1-12的细胞毒性**

MTT实验结果显示：2-吡啶基衍生物(5和11)因形成分子内NH···N_heter氢键而预组织为有利于JAK2结合的空间构象，表现出较高的效力（IC₅₀ = 4.9和10.4 μM）和选择性（SI = 8.8和>4.8），对肿瘤细胞显著毒性高于非肿瘤细胞。相反，邻位羟基衍生物(3和9)通过强OH···O_carbonyl分子内氢键使分子锁定在不利于JAK2结合的构象中，细胞毒性降低。吡嗪基衍生物(6和12)活性明显下降，反映了额外环氮原子的吸电子效应可能削弱与JAK2残基的关键氢键相互作用。噻吩衍生物对HEK293细胞毒性较低以及化合物5和11的优异选择性，与硝呋齐特对组成性STAT3激活细胞的选择性毒性机制一致。

**2.4 化合物1-12的抗菌活性**

呋喃系列(1-6)的活性整体优于噻吩系列(7-12)，这可能归因于呋喃环的电子丰富性有利于细菌酶促硝基还原，而噻吩环的芳香性可能使硝基还原变得不利。在呋喃衍生物中，含间位取代基的化合物2和4活性最高，间位取代模式优化了亲水性（利于琼脂扩散）与疏水性（利于穿透细菌膜）之间的平衡。对革兰氏阴性大肠杆菌活性有限、对铜绿假单胞菌无活性，与硝呋齐特的已知抗菌谱一致，主要归因于外膜通透性差异和主动外排泵的存在。所有化合物对白色念珠菌均无活性。

**讨论与结论**

本研究通过系统比较评价，首次在同一研究中评估了系列硝呋齐特类似物的血清蛋白结合亲和力、细胞毒性和抗菌活性。结果表明，2-吡啶羧酸衍生物(5,11)作为选择性抗肿瘤先导化合物值得进一步研究，而3-羟基苯甲酸衍生物(2)和3-吡啶羧酸衍生物(4)是抗感染药物优化的潜在候选分子。研究建立的构效关系框架为合理设计兼具理想药代动力学特征和生物活性的新型硝呋齐特衍生物提供了理论依据。需要指出的是，这些结果仍属初步发现，在更复杂的生物体系中可能无法完全重现。未来工作拟开展体内实验以评估所选化合物的肿瘤生长抑制效果及基本药代动力学参数。