《International Journal of Molecular Sciences》：Promises and Perspectives of Mesenchymal Stromal Cells in Companion and Farm Animals
间充质基质细胞（MSCs）是异质性、多能性的细胞群体，已成为兽医再生医学中研究最深入的细胞类型之一。它们可以从多种成体和围产期组织中分离出来，并因其免疫调节特性、广泛的分泌活性以及促进组织修复的潜力而引起了极大兴趣。然而，越来越多的证据表明，MSCs不应被视为一种统一的治疗产品，因为其生物学行为受到组织来源、供体特征、生产条件以及受体微环境的影响。同样，目前认为其治疗效果主要通过动态的宿主相互作用产生，包括炎症许可（inflammatory licensing）、免疫调节、分泌的生物活性因子、细胞外囊泡（extracellular vesicles）、代谢交换以及对凋亡细胞的反应，而非仅仅通过持久的植入和直接的组织替代。尽管临床证据支持特定MSC产品可用于犬骨关节炎的治疗，并提示对马肌肉骨骼疾病有应用前景，但大多数其他兽医应用仍处于临床前或研究阶段。本综述批判性地审视了关于MSCs生物学特性、组织来源多样性、分子机制、治疗应用以及在伴侣动物和农场动物中比较转化作用的现有知识。本文还讨论了持续限制临床转化的挑战，包括生物异质性、产品表征、效力评估、生产标准化和监管考量，并强调了开发安全、有效且循证的兽医MSC疗法的未来方向。
2. 间充质干细胞/基质细胞的生物学特性和功能特性
MSCs由从多种组织中分离出的异质性、培养扩增的细胞群组成。不能仅凭塑料贴壁性、表面标志物表达或三系分化来推断其特性，因为这些特性随组织来源、供体、物种和生产条件而变化。因此，一个有生物学意义的定义需要将细胞表型与相关功能联系起来的汇聚性证据。
2.1. 间充质干细胞/基质细胞的定义和生物学特性
Friedenstein及其同事首次描述了来自骨髓的塑料贴壁、形成集落的成纤维细胞样前体细胞，这些细胞在移植后能生成骨骼和支持性基质。Caplan后来提出了间充质干细胞这一术语，用于指代那些被认为能生成多种间充质组织的细胞。这些观察奠定了MSC研究的概念基础。然而，后续研究表明，常规培养扩增的制剂是异质性的，并不一定代表一个均匀的内源性干细胞群体。
相应地，对MSC功能的解释也发生了变化。持久的植入和直接分化可能发生在特定的实验环境中，但它们很少能完全解释治疗反应。目前的证据表明，MSC活性主要依赖于与宿主组织和免疫细胞的相互作用，而不是永久性的结构替代。Caplan提出了替代术语“药用信号细胞”以强调这些宿主导向效应。这一概念性表述很有用，但它并未取代国际公认的MSC命名法。目前的指南建议保留首字母缩略词MSC，指明组织来源，并避免仅基于培养表型就声称具有干性。
ISCT针对人MSCs的最低标准包括塑料贴壁性、CD73、CD90和CD105的表达、缺乏选定的造血和免疫细胞标志物，以及体外成骨、成脂和成软骨分化能力。这些标准仍然是有用的参考点，但直接应用于兽医物种存在问题。抗原表达因物种和组织而异；对于几种家养动物，经过验证的物种特异性抗体仍然不可用，而针对人蛋白产生的抗体可能表现出弱或不一致的交叉反应性。传代、汇合度、炎症暴露、酶促组织处理和冷冻保存可能会进一步改变测量的表型。
因此，应使用几种互补的证据线来确定兽医MSCs的特性。研究报告应包括物种、供体特征、组织和解剖区室、分离方法、培养和扩增历史、形态学、克隆形成能力、免疫表型以及所用抗体的验证。如果提出治疗用途，还应检查至少一种与预期作用机制相关的功能。这种多维方法是必要的，因为满足常规表型标准的群体可能在增殖、分泌活性、免疫调节、血液相容性和治疗效力方面仍然存在显著差异。
2.2. MSCs的组织来源和生物多样性
MSC或类MSC基质群体已从多种成体、胎儿和围产期组织中分离出来。这些组织包括骨髓、脂肪组织、真皮、骨骼肌、滑膜、骨膜、肌腱、牙髓、子宫内膜、卵巢、肝脏、胎肺、胎盘、脐带、华通氏胶、羊膜和羊水。这种广泛的分布提供了实践上的灵活性，但组织来源也是生物变异的一个主要来源。
比较转录组学和单细胞研究表明，MSC制剂保留了组织相关的分子和功能差异，并包含多个亚群。因此，不应仅仅因为不同组织来源的细胞表达相似的标志物或进行三系分化，就将它们视为可互换的。来源选择应根据预期适应症、采集可行性、生产要求和实验证明的功能来指导。伴侣动物的比较研究同样表明，物种和组织来源影响细胞表型和生物学行为。
2.2.1. 骨髓来源的MSCs
骨髓仍然是经典且特征最明确的MSC来源，并且继续作为许多替代组织来源进行比较的参照标准。骨髓来源的制剂具有明确的克隆形成、成骨和成软骨特性，并在骨、软骨、肌腱和韧带修复方面得到了广泛研究。其长期的研究历史也产生了大量关于扩增、安全性和生产的信息。
然而，采集骨髓具有侵入性，需要镇静或麻醉。形成集落的基质祖细胞只占骨髓有核细胞的一小部分，因此通常需要大量的体外扩增。产量和功能受供体年龄和健康状况、骨骼部位、穿刺质量和培养条件的影响。已在牛、水牛、猪、狗和马中鉴定了骨髓来源的MSCs，而在兽医制剂中已报道了与传代相关的集落形成能力和增殖能力的下降。因此，骨髓仍然是一个重要的生物学参考来源，但在需要微创采集、高初始细胞产量或快速生产的情况下，它可能不太适用。
2.2.2. 脂肪组织来源的MSCs
脂肪组织被广泛使用，因为它丰富且通常能产生相对较大的基质血管成分。采集可以与常规外科手术相结合，或者可以使用原本会被丢弃的组织，尽管采集的侵入性因解剖部位和物种而异。来自主要兽医物种的脂肪来源MSCs通常表现出成纤维细胞样形态、常规间充质标志物的表达和三系分化能力。
这些细胞通常能高效扩增，并且在需要临床相关剂量时可能提供实际优势。它们还表现出免疫调节、营养支持和血管生成相关活性。然而，脂肪组织不是一个均匀的器官。皮下、内脏、关节周围和其他储库在血管化、细胞组成和代谢暴露方面存在差异。更大的初始细胞或集落产量并不能证明其具有更优越的治疗效力。相反，比较证据支持将储库和组织来源与预期应用相匹配，并在最终产品中验证相关的生物学功能。
2.2.3. 围产期组织来源的MSCs
围产期来源包括胎盘、脐带及其定义的区室、华通氏胶、羊膜和绒毛膜、羊水，以及（如果成功分离的话）脐带血。这些材料通常可以在分娩时收集，而不会对母畜或新生儿造成额外的发病率，这使得它们对于供体筛查和细胞库具有吸引力。
与成体组织细胞相比，围产期MSC制剂通常表现出快速增殖和延长扩增的能力，这一特性常归因于它们的发育起源和相对未成熟的基质表型。然而，这种行为并非普遍存在，必须针对每个物种、解剖区室和生产工艺进行确定。已从牛和水牛的脐带、华通氏胶、羊膜和羊水中分离出MSC样群体。在犬和马的围产期组织中也描述了相关群体。
不应将这些组织视为生物学等效的。华通氏胶、脐带衬里、血管周围区域、脐带血、羊膜、绒毛膜和胎盘区室的发育起源和细胞组成不同，因此可能产生具有不同表型和功能的基质群体。出生时收集的胎盘、脐带和胎膜最好描述为围产期或胚外组织，而不是简单地称为胎儿。除非有直接的比较证据支持，否则应避免声称围产期MSCs统一地更原始、低免疫原性或治疗上更优越。
2.2.4. 特化组织来源的基质群体
MSC样基质群体也已从子宫内膜、卵巢、牙髓、牙周组织、真皮、滑膜、骨膜、肌腱、骨骼肌、胎肺、肝脏和几种其他组织中分离出来。这些来源可能保留与其天然微环境相关的特征，因此可能为特定应用提供生物学优势。
牛子宫内膜基质群体已显示出克隆形成能力、间充质标志物表达和中胚层分化能力，而生殖阶段和子宫疾病会改变其特性。卵巢基质群体也已在狗和家畜中进行了研究。然而，干性相关标志物的表达或体外分化能力的证明本身并不能确立体内再生功能。
牙髓和牙周组织含有与神经嵴有发育联系的基质群体。这些细胞可能表现出成骨、成牙本质和神经营养特性，支持它们在牙科、颅面和神经再生应用中的研究。然而，单细胞分析表明，即使在密切相关的牙源来源中，也存在显著的组织、供体和亚群水平异质性。兽医临床证据仍然有限，专门的疗效主张最好作为新兴观点而非既定事实提出。
其他组织相关的群体也可能具有潜在有用的特性，包括滑膜或肌腱来源基质群体的基质产生能力，以及子宫内膜群体的生殖相关性。然而，能够从特定组织中分离出塑料贴壁细胞并不足以成为治疗开发的理由。每个来源都应评估其可重复的产量、生物学稳定性、安全性、可扩展性和适应症相关的效力。此外，应将组织和解剖区室纳入MSC命名法中并一致报告。
2.3. MSC制剂的核心生物学特性
在常规培养条件下，MSC制剂通常贴附于组织培养塑料并呈纺锤形或成纤维细胞样形态。成纤维细胞集落形成单位测定提供了对克隆形成贴壁祖细胞的估计，但结果强烈依赖于接种密度、培养基、孵育时间和评分方法。形态学和塑料贴壁性均非MSCs所特有，因为成纤维细胞和其他基质群体也可表现出相似特征。
因此，免疫表型分析是表征的重要组成部分，尽管尚未有一个通用的兽医标志物组合在不同物种、组织和实验室中得到验证。CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166是兽医MSC制剂中常作为阳性标志物进行评估的标志物，而CD34、CD45和CD31等造血和内皮标志物通常用作排除标志物。然而，表达模式因物种和组织来源而异。CD44和CD90在牛、水牛、犬、马和猪的MSC制剂中经常被报道，而CD29、CD73、CD105、CD166及相关标志物则表现出更大的变异性或未在所有物种中进行统一评估。因此，应报告抗体克隆号、物种反应性、荧光染料、活力区分、设门策略和适当的对照。当物种特异性表达或抗体交叉反应性尚未确定时，某个标志物的缺失并不能自动排除其为MSC制剂。
总的来说，这些研究证明了兽医MSC免疫表型的显著重叠，特别是对于CD44和CD90，但它们不支持一个通用的跨物种标志物组合。CD29、CD73、CD105和CD166也经常被报道，尽管它们的表达以及合适抗体的可用性或交叉反应性因物种和组织来源而异。同样，造血标志物通常不存在或以低水平表达，但不应将单个标志物视为绝对的排除标准。因此，兽医MSC表征应报告物种、组织来源、抗体克隆号和物种反应性、传代和设门策略，而不是根据固定的标志物组合来定义MSC特性。
八聚体结合转录因子4（OCT4）、NANOG、SRY盒转录因子2（SOX2）、阶段特异性胚胎抗原（SSEA）及其他多能性相关分子已在一些兽医MSC培养物中被检测到。这些发现需要谨慎解读。检测到转录本或免疫反应信号并不能证明多能性，可能反映了低水平表达、检测交叉反应性、假基因扩增或培养相关变化。因此，在没有适当功能验证的情况下，不应将这些标志物的表达解释为多能性的证据。
成骨、成脂和成软骨分化仍然是MSC表征的常规组成部分，尽管它本身不能确立干性或治疗效力。应包含适当的阳性和阴性对照，并在可能的情况下辅以组织学、生化或分子评估。对于分化为神经、肝、胰腺、内皮、生殖细胞或心肌细胞样表型的声称需要更加谨慎，因为单独的形态学变化或谱系相关标志物的表达并不能证明获得了成熟的功能性表型。除非有适当的功能证据支持，否则此类结果最好描述为诱导或谱系相关表型。
培养扩增的MSCs最初可能表现出显著的增殖和克隆形成能力，但两者都可能随着长期扩增而下降。单独使用传代数来衡量培养史是不精确的，因为不同实验室的分裂比、接种密度、收获汇合度和培养时间存在差异。因此，累积群体倍增数、群体倍增时间、接种密度和收获汇合度能提供更具信息量的扩增历史描述。
主要组织相容性复合体（MHC）II类和共刺激分子的低基础表达促进了同种异体产品的开发，但MSCs并非普遍具有免疫豁免权。免疫识别因物种、供体-受体相容性、组织来源、炎症许可、培养条件和重复暴露而异。在马中，重复关节内施用某些同种异体制剂产生的炎症反应大于自体治疗，这支持了情境依赖性免疫原性的概念，而非普遍的非免疫原性。
MSCs可以对趋化因子、粘附分子和细胞外基质信号做出反应，并可能向受伤或发炎的组织迁移。然而，全身给药通常导致早期肺部滞留和在目标组织内的有限保留。归巢应更好地被视为一种途径和情境依赖的过程，而不是持久植入的证据。治疗活性可能反而源于与宿主细胞的瞬时相互作用以及宿主对清除或凋亡的MSCs的反应，这支持了从简单的细胞替代模型的转变。
2.4. 生物异质性与生产的影响
MSC异质性出现在多个层面，包括物种、组织和解剖区室、供体、克隆组成、分离方法、培养环境、扩增历史、储存和配方。这些变量可以改变增殖、分化、代谢、分泌组组成、免疫调节和安全性。因此，一个MSC产品不仅由其组织来源定义，还由其生产工艺定义。
供体年龄和健康是重要但尚未完全标准化的变异来源。衰老通常与克隆形成能力降低、分化改变、氧化应激和衰老相关，尽管这些效应的程度因物种和组织来源而异。在牛子宫内膜MSCs中，子宫炎性疾病改变了增殖和转录组特性。品种、性别、生殖阶段、代谢状态、药物和并发疾病也可能影响细胞行为，因此应予报告。
培养基和补充剂强烈影响MSC表型和功能。胎牛血清在兽医MSC培养中仍被广泛使用，但其化学成分不明确、批次可变，并存在异种蛋白、生物安全性和可重复性问题。无血清、无异源、血小板来源和物种适应的补充剂可能改善标准化，尽管培养基组成的改变也会改变细胞生长和功能效力。因此，培养体系应根据目标物种、组织来源和临床应用进行确认。
氧张力是另一个重要的培养变量，因为大气氧浓度超过了多数天然基质生态位的氧浓度。低氧培养可以改变增殖、代谢、迁移、分化和分泌，但反应取决于氧浓度、暴露持续时间、传代、组织来源和物种。在水牛骨髓来源的MSCs中，在5%氧浓度下培养与改善的集落形成和迁移以及HIF-TWIST相关变化有关。这些发现支持对氧张力进行控制性评估，但并不确立一个普遍的最佳浓度。
长期扩增可导致复制性衰老、细胞增大变平、集落形成减少、线粒体应激以及免疫或分泌活性改变。因此，质量评估应包括生长动力学，并在适当时测量衰老和基因组稳定性。维持细胞通过高传代数的能力本身并不能证明产品质量得以保持。
冷冻保存便于建库、运输和即用型使用，但其影响因产品和方案而异。常规形态学和标志物表达可能保持不变，而活力、粘附、代谢恢复、炎症反应性或免疫调节功能可能发生改变。相反，优化的方案可以从多种组织中恢复功能性细胞。未经直接测试，不应假设新鲜和冷冻保存的产品是等效或不等效的。解冻后评估应在预定给药时间点包括活力、细胞回收率和适应症相关的功能效力。
2.5. 从表型表征到功能效力
塑料贴壁性、表面标志物和三系分化支持MSC的特异性和可比性，但不能衡量预期产生临床益处的生物学功能。具有相似常规表型的制剂可能在细胞因子反应性、免疫细胞调节、营养因子释放、细胞外基质产生、血管生成活性、EV输出和代谢适应性方面存在显著差异。
因此，效力测试应与预期的作用机制和适应症相关联。为免疫介导疾病开发的产品可能需要炎症许可、淋巴细胞增殖、单核细胞或巨噬细胞反应或相关可溶性介质的测定。肌肉骨骼产品可能需要基质相关、营养支持、抗炎、血管生成或细胞保护测定，而分泌组和EV产品则需要额外评估其特性、数量、纯度和生物学相关活性。
单一测定不太可能捕捉到异质性MSC产品的全部活性。当每个组成部分都与产品性能相关联时，一套经过验证的互补分析和功能测定矩阵更为可靠。效力应与无菌性、内毒素、支原体、活细胞剂量、特性、纯度、基因组稳定性和批次一致性一起进行解读。
因此，一个兽医MSC产品是由物种、组织和解剖区室、供体、生产工艺、储存和预期用途的相互作用来定义的。建立适用性需要物种合适的试剂、透明的扩增和储存数据，以及一个或多个适应症相关的功能测定，从而将生物学特性与治疗活性联系起来，而不是仅依赖常规标志物组合。
